抗坏血酸清除DPPH自由基的作用机理_李铉军.pdf

1、 2011, Vol. 32, No. 01 食品科学 基础研究86抗坏血酸清除 DPPH 自由基的作用机理李铉军， 崔胜云 *(延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室， 吉林 延吉 133002)摘 要 ： 采用光谱、 电化学和质谱分析方法研究抗坏血酸对 DPPH 自由基清除机理， 发现 DPPH 在溶液中是以自由基形态和含氮 - 氮双键的高度共轭结构的正离子态 (DPPH+)存在且抗坏血酸对上述两种形态都有清除作用。 由于DPPH 自由基与 DPPH+ 在溶液中处于平衡态， 故同种抗氧化剂用 517nm 波长处 DPPH+ 的吸收强度变化可间接评价对 DPPH 自由基的清除作用

2、， 但对不同抗氧化剂而言， 因抗氧化剂对 DPPH 的不同形态相对清除作用的不同会带来较大的误差或误判。 本研究对准确评价抗氧化剂的自由基清除作用具有一定指导意义。关键词 ： 抗坏血酸 ； D P P H 自由基 ； 清除机理 ； 分光光度法 ； 循环伏安法 ； 质谱法DPPH Radical Scavenging Mechanism of Ascorbic AcidLI Xuan-jun， CUI Sheng-yun*(Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain and Functional Molecules, Mini

3、stry of Education,Yanbian University, Yanji 133002, China)Abstract ： DPPH radical scavenging properties of antioxidants are generally evaluated by determining absorbance (A517 nm) at517 nm wavelength. Herein, the radical scavenging mechanisms of ascorbic acid on DPPH radicals were investigated by UV

4、-Visspectrometric, electrochemical and mass spectrometric determinations. It was found that DPPH existed in two different forms,radical form (DPPH ) and highly conjugated form (DPPH+), and ascorbic acid could scavenge both of them in the solution.Generally, the two forms of DPPH were at equilibrium

5、in the solution. This makes it possible to indirectly evaluate DPPHradical scavenging properties of the same kinds of antioxidants based on A517 nm changes of DPPH+, but for different kinds ofantioxidants, it is impossible to correctly evaluate radical scavenging properties because of their differen

6、t relative scavengingeffects on the two forms of DPPH.Key words： ascorbic acid； DPPH free radical； scavenging mechanism； spectrometry； cyclic voltammetry； massspectrometry中图分类号 ： O651 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1002-6630(2011)01-0086-05收稿日期 ： 2010-03-05作者简介 ： 李铉军 (1977 )， 男， 讲师， 硕士， 研究方向为食品分析。 E-mail： * 通信作者

7、： 崔胜云 (1957 )， 男， 教授， 博士， 研究方向为生物分析化学。 E-mail： 体外检测抗氧化剂清除自由基方法中以清除 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基最为常见 1-8。 该方法的基本原理是 DPPH 在溶液中生成一个稳定的含氮自由基且该溶液呈典型的紫色在紫外 - 可见 (UV-Vis)光区具有较强的吸收光谱。 当 DPPH 溶液中加入抗氧化剂时，由于其自由基清除作用使 DPPH 紫色消退导致吸收光谱强度随加入的抗氧化剂的量的增加而减小， 通过加入抗氧化剂前后吸光度的线性变化计算自由基清除率 9-14。 通常抗坏血酸等具有递电子和递质子

8、能力的抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用是通过抗氧化剂把电子和质子传递给 DPPH 自由基， 从而生成稳定的分子态的 DPPH2 的结果 1 5 ， 见图 1 。DPPH 溶液在 323nm 和 517nm 波长处有两个特征的吸收峰 16。 迄今， 抗氧化剂对 DPPH 自由基清除率是通过测定加入抗氧化剂前后 DPPH 在 517nm 波长处吸光度图 1 抗氧化剂递电子、 递质子与 DPPH 自由基生成 DPPH2 的反应式Fig.1 Reaction equation in which electron and proton are transferredfrom antioxidant t

9、o DPPH to form DPPH2DPPH 自由基O2NN NO2NNO2+e ,+H +AntioxidantNO2NO2NNO2NHDPPH287基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 01的变化来计算的 17-19。 但该方法中把 517nm 波长处可见光区的吸收峰视为 DPPH 自由基的吸收峰， 并根据该峰的吸光度随抗氧化剂量的增加线性变化来计算自由基清除率未免牵强。 这是因为 DPPH 自由基的单电子未与其3 个苯环构成完整的共轭结构， 故把可见光区 (517nm)的吸收光谱视为 D PPH 自由基的吸收光谱觉得不妥。 因此， 用上述方法测定自由基清除率时，

10、对某些抗氧化剂而言， DPPH 自由基溶液在 517nm 波长处的吸光度变化并非随加入的抗氧化剂的量的变化呈良好的线性关系 20，故利用该方法评价不同种抗氧化剂的自由基清除率时不免带来误差或误判。 研究者认为 DPPH 溶液在空气氛围中因氧的作用其存在形式除了自由基形态外还可能存在与自由基处于平衡态且在 517nm 波长处具有强吸收的其他形态。 因此， 研究抗氧化剂对 DPPH 自由基和 DPPH其他各种形态的清除机理对正确的利用该方法定量评价自由基清除作用都有重要的意义 21-25。本实验以具有递电子和递氢能力的抗坏血酸作为抗氧化剂， 利用分光光度法、 循环伏安法 (CV)和质谱法比较研究抗

11、坏血酸清除 DPPH 自由基的反应机理。 通过抗坏血酸和 DPPH 混合溶液的循环伏安分析和质谱测定结果， 提出溶液中不同 DPPH 存在形态和抗坏血酸相互作用的反应机理。1 材料与方法1.1 材料、 试剂与仪器1,1二苯基 -2-苦基肼 (DPPH)、 抗坏血酸 美国 Sigma公司 ； 氯化钾、 无水乙醇为国产分析纯试剂 ； 实验用水为三次蒸馏水。UV-8500 紫外 - 可见分光光度计 天美公司 ； M-273电化学分析仪 美国 EG & G公司 ； HP 1100-1946A LC-MS液 - 质联用仪 美国惠普公司。1.2 方法新鲜配制 0.1000mmol/L DPPH 无水乙醇溶

12、液及含有一定浓度的抗坏血酸和 0.1000mmol/L DPPH的混合溶液。分别对 DPPH、 DPPH 和抗坏血酸混合溶液进行 UV-Vis吸收光谱、 循环伏安和质谱测定。 通过比较 DPPH 与抗坏血酸作用前后的光谱、 电化学、 质谱测定结果的变化研究抗坏血酸清除 DPPH 自由基的反应机理。 质谱测定采用无柱色谱端口自动进样， 质谱分析条件为 ： API-ESI离子源， 扫描范围 m/z 100 800， 离子源喷射电压4.0kV， 锥孔电压 70V， 氮气流速 8.5L/min， 毛细 管温度 180， 检测器为安捷伦 1100 型四极杆质谱检测器。2 结果与分析2.1 抗坏血酸和 D

13、PPH 混合溶液的 UV-Vis 吸收光谱由图 2 可知， 抗坏血酸因其羰基与 C2 和 C3 间的不饱合键的共轭作用在 282nm 波长处可观察到羰基的较强的 R 吸收带， 而 DPPH 在 200 250nm 波长范围内可观察到较强的因苯环共轭导致的 k 带、 E 带和 B 带相重叠的末端吸收带， 同时在 323nm 波长处出现 DPPH 自由基单电子的 n * 跃迁导致的吸收带和在 517nm 波长处出现， 可能是由于 DPPH 中的 3 个苯环通过氮 - 氮双键共轭引起的 * 跃迁引起的可见区的吸收带。 从以上紫外光谱分析可推知， DPPH 在乙醇溶液中不仅是以自由基形态存在， 还有可

14、能存在 DPPH 自由基与空气中的氧作用后生成的高度共轭结构的正离子形态 DPPH+ 导致其在可见光区具有强烈的吸收光谱， 其结构见图 3。图 A.抗坏血酸 (0.1000mmol/L)溶液紫外光谱图 ； 图 B： 1.DPPH(0.1000mmol/L)乙醇溶液紫外光谱图 ； 2. DPPH(0.1000mmol/L)溶液与 0.0200mmol/L 抗坏血酸混合溶液的紫外光谱图 ； 3. DPPH(0.1000 mmol/L)溶液与 0.100mmol/L抗坏血酸混合溶液的紫外光谱图。图 2 抗坏血酸和 DPPH 混合溶液的 UV-Vis 吸收光谱Fig.2 UV-Vis spectrum

15、 of aqueous ascorbic acid solution and itsmixture with DPPH ethanol solution0.120.100.080.060.040.020.00282nmA波长 /nm150 300 450 600 750A3.53.02.52.01.51.00.50.0325nmA波长 /nm150 300 450 600 750 900B517nm123图 3 DPPH 自由基和其高共轭结构氧化产物的化学结构图Fig.3 Chemical structure of DPPH radical and highly conjugatedoxida

16、tion productDPPH 自由基O2NNO2NNO2 e+eNO2NO2NNO2NDPPH+N当 DPPH 溶液中加入 0.02mmol/L 抗坏血酸时， 末端吸收和 323nm 波长处的吸收带及 517nm 波长处的吸收带的吸收强度都在明显减小 (图 2B)， 其中波长 517nm 处的吸光度从 1.07 减小到 0.86， 而在 323nm 波长处的吸光2011, Vol. 32, No. 01 食品科学 基础研究88图 7 抗坏血酸的氧化反应Fig.7 Oxidation raction of ascorbic acidO OHOOHOHCH2OH 2H+, 2eO OOOHOC

17、H2OH度从 1.51 减小到 1.32， 说明低浓度的抗坏血酸对 DPPH自由基和正离子态的 DPPH+ 都具有清除作用。 在实验中也发现， DPPH 溶液加入抗坏血酸后溶液由浅蓝色变为无色， 这是由于抗坏血酸对有色的正离子态的 DPPH+ 具有分解清除作用所致。 当加入的抗坏血酸浓度增加至与DPPH 浓度 (0.1mmol/L)相等时， DPPH 的末端吸收大大降低的同时 517nm 波长处的吸收带几乎消失， 但 323nm 波长处的吸收带仍有较大的吸收且溶液的颜色从蓝色完全变为黄色。 这一结果说明 ： 当抗坏血酸浓度较高时，抗坏血酸的还原性导致其直接还原 DPPH+的氮 -氮双键并使其分

18、解生成具有如下共轭结构的产物 (图 4)。2.2 抗坏血酸与 DPPH 混合溶液的 CV 测定结果为了进一步探讨在氧化还原氛围中 DPPH 的可能存在形态， 利用 CV 分别测定了新鲜配制的 DPPH、 抗坏血酸和两者混合溶液在 KCl 底液中的 CV 曲线 (图 5)。由图 5 可知， DPPH 溶液在 0.0 1.0V(vs.Ag|AgCl)电压范 围内， 在峰电位 E pa1=0.480V， E pc2=0.399V 和Epa2= 0.786V， Epc1=0.690V 处分别观察到两对准可逆的氧化还原峰， 说明 DPPH 在氧化还原氛围中至少存在 3 种氧化还原形态 ； D P P H

19、 自由基、 负电位下的还原态DPPH 2、 正电位下的氧化态 DPPH +， 结构见图 6。图 6 DPPH 不同氧化还原形态的化学结构图Fig.6 Chemical structures of DPPH with different redox states图 5A 中的第一对氧化还原峰 (峰电位分别为 Epa1=0.480V和 Epc2=0.399V)分别是 DPPH2 氧化成 DPPH自由基和 DPPH 自由基还原成 DPPH2 的氧化还原峰， 而第二对氧化还原峰 (峰电位分别为 EPa2=0.786V和 Epc1=0.690V)分别为 DPPH 自由基氧化成 DPPH+ 和 DPPH+

20、 还原成 DPPH 自由基的氧化还原峰。 从峰电流和峰电位差值判断这两对氧化还原过程近乎可逆的单电子转移氧化还原反应， 其条件电位近似为 ：0.768+0.690EDPPH+/DPPH 自由基 0.729V20.480+0.399EDPPH 自由基 /DPPH2 0.440V2因此， 空气氛围的 DPPH 溶液中其自由基形态易被氧所氧化生成 DPPH+ 形态 (因氧气的标准电极电位值较大E O2/H2O=1.23V， 并可能以 DPPH+ 和 DPPH 自由基两种形态的平衡态存在。 从图 5B 抗坏血酸的 CV 图中发现抗坏血酸在峰电位为 Epa1=0.393V(vs.Ag|AgCl)处出现灵

21、敏的氧化峰电流， 但其还原电流相对较小且不出现峰型。 由于抗坏血酸两电子转移的标准电极电位为 11mV(vs.SHE)，故其还原型具有相对较强的还原性易在 CV正半轴扫描中出现失去两个电子变成氧化型并产生灵敏的氧化峰电流(图 7 )。图 4 DPPH+ 与抗坏血酸作用产物Fig.4 Interaction product between DPPH+ and ascorbic acidDPPH 自由基O2NNO2NNO2-e,H+NO2NO2NNO2NDPPH2NH+e,H+NO2 N NO2NO2NDPPH+ e+eO2NNO2NNO2O2NO2NNO2HNNO OOHCH2OHOHHO0 2

22、 4 6I/AE/V1.2 0.8 0.4 0.0B +EPa1=0.393VA.DPPH 溶液 (0.1000mmol/L)的 CV 图 ； B.抗坏血酸溶液 (1.000mm ol/L )的 CV 图 ； C. DP PH( 0. 100 0m mol /L )和抗坏血酸(1.000mmol/L)混合溶液的 CV 图 ； 电解质为 0.1mol/L KCl。图 5 DPPH 和抗坏血酸混合溶液的 CV 曲线Fig.5 Cyclic voltammograms (CVs) of DPPH solution, ascorbic acidsolution and their mixture0 2

23、 4 6I/AE/V1.2 0.8 0.4 0.0CEPa2=0.747VEPa1=0.462V+E/V1.2 0.8 0.4 0.00.40.0 0.4 0.8 1.2EPc2=0.399VI/AEPc1=0.690VEPa1=0.480VEPa2=0.786VA+OIOIOI89基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 01由图 5 可知， DPPH 在抗坏血酸作用下在 CV 图的正半轴扫描过程中分别在 Epa1=0.462V和 Epa2=0.747V处出现比图 5A 中 DPPH 所对应的两个氧化峰电流大得多的氧化峰电流， 其中 Epa1=0.462V 的氧化峰电流增加特

24、别明显。 这是因为抗坏血酸对 DPPH 自由基的清除作用使溶液中的 DPPH 自由 基生成非自由基态的 DPPH2 的缘故，同时 CV 图的负半轴上观察不到明显的 DPPH 的还原峰，说明抗坏血酸对 DPPH+ 和 DPPH 自由基具有很强的清除作用。2.3 抗坏血酸与 DPPH 相互作用的质谱为了探讨选定的质谱测定条件下 DPPH 的存在形态， 首先分别采用正、 负离子模式对 DPPH 溶液进行质谱测定 (图 8)。为了进一步探讨抗坏血酸与 DPPH 的作用机理， 采用负离子模式分别对 DPPH、 抗坏血酸及两者混合溶液进行质谱测定， 结果见图 9 。图 8 DPPH(0.2000mmol/

25、L)乙醇溶液在正离子模式 (A)和负离子模式 (B)质谱图Fig.8 MS spectra of 0.2000 mmol/L DPPH ethanol solution in positivemode (A) and negative mode (B)100500A相对丰度/%m/z100 200 300 400 500 600 700 800392.1394.1N NO2NO2NNO2m/z=394100500B相对丰度/%m/z100 200 300 400 500 600 700 800439.0394.0N NO2NO2NNO2m/z=394 HDPPH2+2Na-2H由图 8 可知，

26、 DPPH 溶液在正、 负离子模式中均在m/z=394 处出现 DPPH 离子峰， 说明溶液中的 DPPH 自由基在电喷雾过程中易在正离子模式下氧化或负离子模式下还原成相对稳定的氧化、 还原态。 在正离子模式下， DPPH 自由基氧化成高度共轭 DPPH+ 形态， 其质荷比为 m/z=394。 在负离子模式下， DPPH 自由基得到质子和电子生成 DPPH2， 并在 m/z=394 处出现其脱质子分子离子峰。 图 8A 中 m/z=392 处出现的离子峰可能是电 喷雾过程中 DPPH脱掉夹在两个硝基中的活泼氢原子后的正离子峰， 图 8B中 m/z=439处观察到的离子峰可能是 DPPH分子中上

27、述两个氢原子被两个钠取代产物的负 离子峰。H图 9 0.2000mmol/L DPPH(C)、 0.2000mmol/L 抗坏血酸 (B)及两者等量混合溶液 (A)的质谱图Fig.9 MS spectra of 0.2000 mmol/L DPPH ethanol solution, 0.2000mmol/L aqueous ascorbic acid solution and their half-and-half mixture100806040200相对丰度/%m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z=113OOHCH2OHB113.0175.0

28、 HOO OH -Hm/z=175100806040200相对丰度/%m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500C439.0N -Hm/z=394394.0NO2NNO2O2N100806040200相对丰度/%m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500113.0NO2NO2Nm/z=113OOO OOHCH2OH-H-H172.9m/z=173 226.9254.9394.0439.0NH NO2-Hm/z=394A-HH由图 9 可知， 在抗坏血酸和 DPPH 混合溶液中， 因抗坏血酸易与 DPPH 作用并氧化脱掉两个氢生

29、成氧化型醌式结构使其脱质子分子离子峰在 m/z=173 处出现 (图9A)， 而新鲜配制的抗坏血酸溶液的脱质子分子离子峰在 m/z =175处出现 (图 9B)。 而在混合溶液中 (图 9A)， m/z=394处可观察到很强的 DPPH2 的脱质子离子峰， 同时在 m/z=226.9 和 m/z =254.9处分别观察到 DPPH+ 被抗坏血酸还原分解的产物 离子峰。 这一结果说明 ： 抗坏血酸对 DPPH自由基清除作用包括递电子和质子与 DPPH 自由基生成DPPH2 的清除作用也可能包括分解 DPPH+ 的清除作用。2.4 抗坏血酸清除 DPPH 自由基机理从上述的讨论中发现， DPPH

30、在溶液中是以 DPPH自由基和该自由基被空气中的氧氧化生成的具有高度共2011, Vol. 32, No. 01 食品科学 基础研究90轭结构的 DPPH + 的两种形态的平衡态存在。 因此， 抗坏血酸对 DPPH的清除作用主要涉及对 DPPH的上述两种形态的清除作用。 综合上述光谱、 电化学、 质谱分析结果发现抗坏血酸对 DPPH 自由基的清除作用包括以下两个途径 ： 1)通过直接的还原作用把电子与质子传递给DPPH 自由基氮原子上的单电子生成 DPPH2。 2)抗坏血酸和与 DPPH 自由基处于平衡态的 DPPH+ 发生氧化还原反应并还原 DPPH+ 的氮 - 氮双键使其分解生成三硝基苯胺

31、， 或者该分解产物与抗坏血酸的醛基作用生成异氰酸酯产物的过程。 其分解过程和图 9A 的质谱图中相应的离子峰的解析见图解 10。interaction of tannins with co-existing substances.VI.: Effects of tanninsand related polyphenols on superoxide anion radical and on 1,1-diphe-nyl-2picrylhydrazyl radicalJ. Chem Pharm Bull, 1989, 37: 2016-2021.2 TAKAKO Y, DONG E B, TAKA

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41、0-112.3 结 论通过 DPPH、 抗坏血酸和两者混合溶液的 UV-Vis 吸收光谱、 C V 和电喷雾质谱测定研究可得出如下的结论 ： 1)由于氧的作用 DPPH 溶液通常是以 DPPH 自由基和 DPPH+ 两种形态的平衡态存在。 其中 DPPH+ 在分子结构上具有高度的共轭结构， 故在波长 517nm 可见光区具有较强的吸收光谱。 2)抗坏血酸对 DPPH 自由基的清除作用包括递电子、 递质子与 D P P H 自由基使其生成DPPH2的过程也包括通过还原 DPPH+氮 -氮双键使其分解成三硝基苯胺的清除作用。 3)利用 DPPH 在 517nm 波长处吸光度的变化来评价抗氧化剂的自

42、由基清除率的方法只考虑到抗氧化剂对 DPPH+ 的清除作用， 而未考虑与其处于平衡态的自由基形态的清除作用， 故方法上有一定的缺陷。 由于 DPPH 自由基与 DPPH+ 可能处于平衡态，故同种抗氧化剂对 D P P H + 的清除作用可间接反映对DPPH 自由基的清除作用， 但利用该方法评价不同种的抗氧化剂自由基清除率时， 可能由于不同抗氧化剂对DPPH不同形态的相对清除作用的不同会带来较大的误差或误判。参考文献 ：1 HATANO T, EDAMATSU R, HIRAMATSU M, et al. Effects of the图 10 抗坏血酸清除 DPPH 自由基机理Fig.10 Schematic diagram of radical scavenging mechanism ofascorbic acid on DPPH radicalsO2NNO2NN NO2 N NO2NO2NNO2O2NO2NN NH(H+e-)NO2-Hm/z=394H2NO2NO2NNO2m/z=227NO2NO2NNO2m/z=255COOOHO OHOHCH2OHOOHO OHOHCH2OHOOHO OHOHCH2OHm/z=173-H -H-H