1、白花泡桐优树组织培养及产业化快繁技术,引言,我国是木材需求大国，自 1999 年以来，我国进口木材及其制品耗汇每年均在 100 亿美元以上（马花如，2011）。随着人类对环境保护意识的增强，我国对生态脆弱区的天然林实行了商品性禁伐，对国有林区实行了减产限伐，进一步减少了我国木材供给，加剧了我国木材供需矛盾（马花如，2011）。尽管自 2002 年以来，我国把发展速生丰产林纳入林业六大工 程，在一定程度上促进速生丰产林的进一步发展，但据统计，从 2003 年到 2009 年 7 年间，我国营造速生丰产用材林平均生长量仅为 9-12 m3hm-2a-1，远远低于新西兰、瑞典、巴西等 国家的 30
2、m3hm-2a-1左右水平（陈桂英和吴宣明，2007）。所以发展适合我国立地条件的速生丰产林树种，充分挖掘我国林地供给潜力，提高我国速生丰产用材林木材的产量和质量，对我国林业工程及经济发展具有重要的意义。,材料,2015 年 5-6 月份，从桂林植物园白花泡桐优树种质园中, 采集当年生嫩枝为外植体材料。,白花泡桐消毒、接种及初代培养,将白花泡桐当年生枝条置于质量浓度为 1%的洗洁精水溶液中浸泡 15 min，取出后用流水冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为 70%的乙醇浸泡 60 s，取出后再置于质量 浓度为 0.1%的 HgCl2中浸泡灭菌，灭菌时间分别为 5、6、7 和 8 min，取
3、出后用无菌水清洗 35 次。将经过消毒处理的白花泡桐枝条剪切成含有 1 或 2 个腋芽的茎段，将茎段接种到初代诱导培养基中，每个处理 30 瓶，每瓶接种外植体 1 个，重复 3 次，两周后进行观测。 白花泡桐初代诱导培养基为 MS+6-BA 1.03.0 mgL-1+IBA 0.2 mgL-1+蔗糖 30 gL-1+琼 脂 3.5 gL-1（pH 5.8），6-BA 取 1.0、2.0、3.0 mgL-1三个水平，共设计 3 个处理，接种时每 个处理 60 瓶，每瓶接种白花泡桐茎段 1 个，重复 3 次；之后，置于温度 263、光照时间 1012 hd-1、光照强度 40 molm-2s-1的
4、条件下培养，每隔 35 d 观测记录材料的生长情况， 及时清理污染材料，30 d 后观察记录幼苗生长状态及诱导率。,白花泡桐增殖培养,将初代诱导培养基中获得的无菌幼苗剪成带有 12 个腋芽的茎段，接种于白花泡桐增殖培养基中进行增殖培养。 初步的继代增殖培养试验设计：培养基为 MS+6-BA 3.05.0 mgL-1+IBA 0.30.5 mgL-1+蔗糖 30 gL-1+琼脂 3.5 gL-1（pH5.8），6-BA 取 3.0、4.0、5.0 mgL-1三个水平，IBA 取 0.3、0.4、0.5 mgL-1三个水平，共设计 9 个处理，三次重复；筛选出适合的 6-BA 和 IBA 的浓度和
5、配比。,白花泡桐增殖培养,后续的继代增殖培养试验设计：根据初筛实验，获得适合的 6-BA 和 IBA 的浓度和配比， 但在这一条件下连续培养 5 代后，发现产生较多的玻璃化材料，因此，保持 6-BA 与 IBA 浓 度比例不变，降低二者的浓度进行后续的继代增殖培养试验。所采用的培养基为 MS+6-BA 0.24.0 mgL-1+IBA 0.020.4 mgL-1+蔗糖 30 gL-1+琼脂 3.5 gL-1（pH 5.8），其中，6-BA 和 IBA 的浓度组合分别为 0.2 和 0.02、0.4 和 0.04、2.0 和 0.02、4.0 和 0.4 mgL-1，共设计 4 个 处理，三次重
6、复。上述每个处理 10 瓶，每瓶 6 个接种点，接种后置于温度 263 、光照时 间 1012 hd-1、光照强度 40 molm-2s-1的条件下培养。每 25 d 为一代，连续进行 6 次继代。统计各个处理每一代的增殖系数、长势（叶片颜色、苗高及茎杆的粗细等）和玻璃化率等，分析植物生长物质浓度和继代次数对白花泡桐增殖培养的影响。,白花泡桐增殖培养,交替继代增殖培养试验设计：前述的继代增殖实验结果表明，不论在高 6-BA 和 IBA 浓 度或低 6-BA 和 IBA 浓度的培养基上进行连续继代，均无法达到理想的增殖效果，还需对继代培养方案进行进一步改善。根据前述的继代实验结果，以高浓度植物生
7、长物质增殖培养基 MS+6-BA 4.0 mgL-1+IBA 0.4 mgL-1+蔗糖 30 gL-1 和低浓度植物生长物质增殖培养基 MS+6-BA 0.4 mgL-1+IBA 0.04 mgL-1+蔗糖 30 gL-1进行交替继代，每 25 d 为一代，连续 6个世代，统计各个处理每一代的增殖系数、长势（叶片颜色、苗高及茎杆的粗细等）和玻璃化率等，以确定白花泡桐继代增殖培养方案。,白花泡桐组培苗生根培养及炼苗移栽,选择高浓度植物生长物质增殖培养基上培养所得的株高 4 cm 以上、植株正常粗壮的芽 苗为生根材料，转入生根培养基中进行生根培养。生根培养基为 1/2MS+NAA 0.10.3 m
8、gL-1+蔗糖 20 gL-1+琼脂/卡拉胶 3.4 gL-1（pH 5.8），NAA 取 0.1、0.2、0.3 mgL-1三个水平， 以琼脂和卡拉胶分为两个组，每组设计 6 个处理，每个处理 10 瓶，每瓶接种白花泡桐无根 苗 6 株，重复 3 次。接种后，将材料置于温度 263、光照时间 1012 hd-1、光照强度 40 molm-2s-1的培养室中培养；每隔 35 d 观测植株的生根情况，培养 14 d 后，观测统计各 处理幼苗的根数、根长、根毛、生根率及植株长势等。将所得的生根苗置于 70%遮阴度的 大棚中炼苗 57 d 后，取出并洗净根部培养基，移栽于装有消过毒的移栽基质（红壤土
9、： 泥碳土=2:1)的营养杯（12 cm12 cm）中，每个处理移栽 30 株、重复 3 次，在温室大棚培 养 50 d 后，对比观察株高、地径及成活率等。将低浓度植物生长物质增殖培养基上培养所得的株高 4 cm 以上、植株正常粗壮的芽苗为生根材料，按照上述方法，同时进行生根培养和炼苗移栽实验，以比较不同的继代增殖培养方式对白花泡桐组培苗生根和移栽的影响。,A. 初代诱导芽苗；.B. 在 MS+6-BA 4.0 mgL-1 +IBA 0.4 mgL-1上继代培养获得的芽苗；C. 在 MS+6-BA 04 mgL-1 +IBA 0.04 mgL-1继代培养获得的芽苗；D.以卡拉胶和琼脂为支撑物进
10、行生根培养获得的水洗生根苗；E. 组培苗移栽于大棚.。,结论与讨论,白花泡桐种苗组培繁育研究已零星报道。史保新（2005）在白花泡桐体细胞胚胎发生及植株再生的研究中发现，白花泡桐叶片和茎段胚性愈伤组织诱导的适培养基分别为 MS+6-BA 14.0 mgL-1+NAA 0.3 mgL-1和 MS+6-BA 8.0 mgL-1+NAA 0.3 mgL-1，叶片的体细胞胚胎发育能力均高于茎段。邓建军等（2011）在白花泡桐优树试管嫁接幼化及组培快繁技术研究中发现，所研究的白花泡桐优树组培快繁佳继代培养基为 1/2 MS+6-BA 6.0 mgL-1+NAA 0.3 mgL-1,繁殖系数4.65/25
11、 d;佳生根培养基为1/2 MS+ NAA 0.1 mgL-1,培养 20 天生根率 85%。李芳东等（2010）在对 13 个不同的白花泡桐优树进行组培快繁研究中发 现，白花泡桐适继代增殖培养基为 1/2 MS+6-BA 4.0 mgL-1+NAA 0.3 mgL-1，生根培养基为 1/2 MS+ NAA 0.1 mgL-1；不同的优树在上述适增殖培养基中增殖系数不同，变化幅度 1.505.57/30 d。王和乐等（2003）通过研究提供了改良白花泡桐组培快繁的初代（MS+6-BA 0.60.8 mgL-1+NAA 0.2 mgL-1）、增殖（MS+6-BA 2.54.0 mgL-1+NAA
12、 0.2 mgL-1）和生根培 养基（1/2 MS+NAA 0.4 mgL-1或 IBA 0.30.5），生根培养 15-20 d，生根率 100%。繁殖系数未明。上述这些研究各有侧重点，所提供的数据和结果也不尽相同，未能对白花泡桐种苗组培快繁过程提供比较系统、详细及完整的技术资料。,结论与讨论,在本文中，我们在前人的研究基础上，从外植体消毒、初代培养、继代增殖和生根培养四个与种苗快繁相关的环节，对自选育的白花泡桐优树进行种苗组培快繁研究，获得了与前人不同的研究经验和结果。首先，在外植体消毒过程中发现，由于白花泡桐嫩枝茎节中空，消毒灭菌时升汞渗入茎杆内部、从而对其造成伤害，导致污染率和死亡均比
13、较高（江香梅等，2009）；我们采用从基部整枝切下、整枝消毒的方法，利用隔层将中空的内腔与外部隔绝，避免了内腔在消毒前后暴露于空气、洗涤液和消毒液中，使得消毒成功率和成活率大大提高。 其次，在初代诱导培养过程中发现，培养基中 6-BA 和 IBA 浓度过低，芽诱导率低、生 长慢；浓度过高，则产生大量的愈伤组织，芽生长受到抑制；比较合适的 6-BA 和 IBA 浓度 为 2.0 和 0.2 mgL-1。,结论与讨论,第三，在继代增殖培养过程中发现，在单一植物生长物质的培养基上长期继代，如果植物生长物质浓度偏高、则产生比较多的玻璃化材料，浓度偏低、则生长速度和繁殖速度下降；长期使用较高浓度的植物生
14、长物质可能是组织培养中玻璃化产生的一个主要原因；针对这一问题，我们采用植物生长物质高浓度（6-BA4.0mgL-1、 IBA0.4mgL-1）和低浓度（6-BA 0.4 mgL-1、IBA 0.04 mgL-1）交替培养的方法，获得了增殖 系数大于 6.0/25d 的良好效果，在保证白花泡桐增殖效率的同时解决了白花泡桐组培苗玻璃 化严重的问题；这一增殖效果等于江香梅等（2009）但高于曲金柱等 （2006）所得的增殖 系数。第四，在生根培养研究中发现，白花泡桐的佳生根培养为 1/2MS+NAA 0.2 mgL-1；但当以琼脂为支撑物时，苗基部会产生比较大的愈伤团，长成的根系上有很多根毛，附着较多培养基，极不容易清洗；而以卡拉胶作为培养基支撑物时，植株基部的愈伤团变小，长成的根系根毛少而且短，移栽时清洗容易，省工省时，也降低了洗苗过程中的机械损伤，保证较高的移栽成活率。上述研究结果和经验为该白花泡桐优株种苗组培快繁产业化提供技术支撑，也为白花泡桐其它优株和泡桐属其它种提供研究经验和技术参考。,谢谢,
