1、 测定脯氨酸药品配制及操作1、药品2、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1 个、50ml 容量瓶 6 个、试管 6 支（制作标曲应用） 、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。3、溶液配制酸性茚三酮溶液：将 1.25g 茚三酮溶于 30ml 冰醋酸和 20ml 6mol/L 的磷酸中，搅拌加热（70）溶解贮于冰箱中。6mol/L 磷酸：浓度为 85%的磷酸大约是 14mol/l，如果要配置 6M 的磷酸大约稀释到原来体积的 2.3 倍即可。3%的磺基水杨酸：3g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至 100ml。冰醋酸甲苯四、试验步骤1、 标准曲线的制作(1)在分析天
2、平上精确称取 25 mg 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入 250 ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸 100 g。(2)系列脯氨酸浓度的配制取 6 个 50 ml 容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 及 3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5 及 6 gml-1。(3)取 6 支试管，分别吸取 2 ml 系列标准浓度的脯氨酸溶液及 2 ml 冰醋酸和 3 ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热 30 min。表 2-5 脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列 Pro
3、溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入 5 ml 甲苯，振荡 30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于 520 nm 波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算 2 ml 测定液中脯氨酸的含量 (g2 ml-1)。2、茎脯氨酸含量的测定(1)脯氨酸的提取：每个树种随机取当年生茎段若干段，用去离子水洗
4、净后，每个重复称取茎段 0.5 g，剪碎，分别置大管中，共 3 个重复。然后向各管分别加入 5 ml 3的磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，在沸水浴中提取 10 min，( 提取过程中要经常摇动使脯氨酸迅速释放)，取出试管冷却至室温待用，冷却后即为脯氨酸的提取液。(2)吸取 2 ml 提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入 2 ml 冰醋酸及 3 ml 酸性茚三酮显色液，在沸水浴中加热 40 min，溶液即呈红色。(3)冷却后加入 5 ml 甲苯，充分摇荡 30 s，静置片刻。 （取上层液至 10ml 的离心管中，在 3000r/min 下离心 5min）(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶
5、液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上 520 nm 波长处比色，求得吸光度值。根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出 )2 ml 测定液中脯氨酸的含量 (Xg2 ml-1)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。配合公式(8)计算茎脯氨酸含量：脯氨酸含量（g/g） /1000000 (8)AFWVX式中：X 为从标准曲线上查得脯氨酸浓度 （g） ，V 为提取液总体积（5 ml） ，FW 为针叶的质量（g） ，A 为测定时所吸取的体积（ 2 ml） 。5、注意事项1.酸性茚三酮溶液宜现配现用，或配好后贮于 4冰箱中 2-3d 可用。2.提取过程中应注意经常摇动大管，以使脯氨酸提取彻底。3.
6、反应液中各试剂需按顺序加入。植物体内脯氨酸含量的高低是反映植物抗逆性强弱的指标之一 i。植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与品种的抗逆性有关。植物的抗寒性与脯氨酸的含量存在相关性 ii。游离脯氨酸的抗寒性作用是调节和维持结冻前融冻后原生质与环境的渗透平衡，防止水分散失，促进蛋白质与水的结合，增加蛋白质的可溶性 iii。游离的脯氨酸可以提高植物组织液的浓度，降低结冰点，从而起到保护细胞、组织的作用。因此可以认为脯氨酸含量可以作为衡量植物体的抗寒性的指标。游离脯氨酸累积对植物抗逆性的生理作用表现在：(1)作为渗透调节物质； (
7、2)作为脱水剂；(3)作为氮源的贮藏形式，并作为植物受环境胁迫时植物生物氨的解毒剂；(4) 作为呼吸底物或能源物质 iv。脯氨酸区别于其他构成蛋白质的氨基酸，它可以促进蛋白质水合作用，亲水、疏水表面的相互作用，脯氨酸含量的增多使可溶性蛋白增多，其原因是促进蛋白质胶体的亲水面积增大。从而，植物受到低温胁迫时，脯氨酸增多进而使植物抗性增大达到自我保护的作用。有研究表明，抗逆性强的植物在受到外界环境胁迫时积累的脯氨酸量多于抗逆性弱的植物受到外界环境胁迫时积累游离脯氨酸的量，由此看来，植物体内积累游离脯氨酸的量可以作为评价植物抗逆性的一个生理指标 v,vi。吴国训等人在对刨花楠对低温响应的研究中，通过
8、对游离脯氨酸含量的变化和电导法测定刨花楠抗寒性比较发现，游离脯氨酸可以作为评价植物抗逆性的指标 112。有研究者认为，脯氨酸含量的增加可以降低小麦叶片渗透势，防止细胞脱水 vii。也有研究者认为，植物体内游离脯氨酸的积累量与其所受的胁迫程度呈正相关，因此可以作为植物所受胁迫强弱的指标。韩蕊莲 viii等人的研究表明，游离脯氨酸的连续积累对提高植物抗逆性有着一定的帮助。本研究中随着脱锻炼的进行，6种观赏植物的抗寒性下降，游离脯氨酸的含量也随着下降(图6) ，与韩蕊莲的研究结果一致。由此在本研究中，游离脯氨酸的含量可以作为评价此6种观赏树种抗寒性的一项指标。i 职明星,李秀菊. 脯氨酸测定方法的改
9、进J. 河南科技学院学报, 2005,4(33)10-12. ii Cleff MD. Proline accumulation during the environmental stressJ. Crop Science, 1983, 23(1): 23-26.iii 汤章成. 逆境条件下植物体脯氨酸的累积及可能意义J. 植物生理学通讯, 1984, (1): 15-27.iv 罗华健,刘星辉. 水分胁迫条件下枇杷若干生理指标的变化J. 亚热带植物科学,2004,33(1):19-21.v 吴国训 ,吴田兵,查宝源,等. 低温胁迫对刨花楠苗期细胞保护系统及生理生化物质的影响J. 江西林业科技
10、 ,2008, 4, 14-16. vi 王宝山. 生物自由基与植物膜脂伤害J. 植物生理学通讯,1988,24(2):12-16.vii Sun J-Y, Zhao Y-T. Study on the p rotective function and mechanism of cellwall glycop roteins in salt tolerance of wheatJ. Scientia Agricultura Sinica, 1997, 30(4): 9-15. viii 韩蕊莲 , 李丽霞,梁宗锁 . 干旱胁迫下沙棘叶片细胞膜透性与渗透调节物质研究 J. 西北植物学报 2003, 23 (1): 23-27.
