1、无菌/洁净室化学气体熏蒸灭菌技术及验证广州思锐净化技术中心（13560240791）提供，仅供参考无菌/洁净室要求对室内微生物进行灭菌或消毒处理。在国内实际运行中，无菌/ 洁净室经常采用甲醛、戊二醛、过氧化氢、过氧乙酸蒸气对环境进行熏蒸灭菌。尽管甲醛由于是致癌物，在发达国家已不用，但在国内，由于甲醛和戊二醛是两种价廉易得的化学灭菌剂，仍有较多用户，以下通过对甲醛气体灭菌的叙述，来介绍化学气体熏蒸灭菌的技术及验证方法。 （由广州思锐净化技术中心（13560240791）提供，仅供参考）（1）甲醛气体熏蒸灭菌：在非最终灭菌的无菌药品制造环境中，甲醛气体主要用于无菌或半无菌室的空气灭菌和进入药品制造
2、工房的原辅材料的外包装灭菌，通常采用可加热熏蒸或常温气化熏蒸方式来灭菌，小型半无菌环境也常采用甲醛与高锰酸钾中和，利用高锰酸钾的氧化能力使甲醛汽化的方法来灭菌。甲醛及其聚合物三聚甲醛的理化数据见表 1。表 1 甲醛及其聚合物三聚甲醛的理化数据表序号 项目 甲醛 三聚甲醛1 分子量 30 90.082 相对密度（纯品） 0.185 1.173 沸点 -19.5 114.54 凝固点 -117 615 蒸汽压 20时，4.525atm 25时，13mmHg6 气化热 5.507kcal/mol184kcal/kg7 闪点 50 448 自燃点 430 4109 爆炸极限 7.2%73.0% 3.6
3、%28.7%10水溶液相对密度沸点闪点37%40%1.0751.0810185可溶于水、醇、醚11 生产环境允许浓度 3mg/m312 立即危及生命和健康的浓度（IDLH） 100g/g甲醛使用量：甲醛的使用量是一个很复杂的问题，其具体用量应基于甲醛气体消毒的最基本的条件进行试验，主要取决于 3 个方面的因素，即对特定空间、特定的甲醛分布方法，甲醛的浓度和使用时的温度、湿度。灭菌实验结果表明，甲醛气体 1mg/L（气体分压为 0.60.8mmHg） ，作用时间在 2050min 时细菌死亡。目前一般采用 40%浓度的甲醛液体 2030ml/m3，或含量 3%甲醛和 50%乙醇混合液 10ml/
4、m3。甲醛汽化方法a.加热汽化：通常先停止空调运行，将含量为 40%的按被灭菌空间场所计算所需数量的甲醛液体，置于一个耐热容器内，对容器进行加热汽化，然后将甲醛蒸气引入灭菌空间，放置一定的时间后，用氨水中和，然后，用无菌新鲜空气置换灭菌空间的废气，置换完毕后，残余甲醛应在 0.5g/g以下，空调系统恢复正常运行。一般加热汽化方法为下述 3 种。.专用加热汽化装置（蒸汽或电加热） ，将汽化后甲醛气体直接引入室内，此法的优点是甲醛气体定量精确，灭菌效果较好，残余气体容易置换。.通过空调器将加热汽化后的甲醛气体送入室内，此法的优点是甲醛气体在室内分布均匀，但由于甲醛对空调系统的腐蚀性，对设备腐蚀严重
5、，同时，由于甲醛的聚合物生成三聚甲醛滞留在空调系统中，尤其是过滤器上的吸附，残留臭气置换困难。.室内用小型容器直接加热蒸发，此法适用于小型空间的灭菌，但操作控制不便，属临时性措施。加热气化的缺点是甲醛气化扩散力较弱，需借助外在动力如空调的送风来促进扩散，且由于消毒时，在高温汽化，易产生冷凝，会导致消毒对象表面生成物乌洛托品形成白色粉末状残留下来，增加无菌环境的微粒数量，加大了空调系统的空气净化负荷。尤其在空调换气次数不够大的环境中，甲醛的聚合物微粒会长时间滞留在室内，且甲醛臭气也不能迅速消失。b.常温汽化：广州思锐（13560247961）引进国外先进的消毒技术与设备，用机械雾化器将定量甲醛（
6、或其它高效消毒剂）液体雾化成超微小的液滴，在常温下自然气化，布满目标空间进行灭菌。常温气化技术自动化程度高，可完全避免加热气化的弊端，无需借助空调的送风来促进扩散，在空调系统中无甲醛的聚合物滞留，过滤器上不会吸附。且由于消毒时，在常温下汽化，不产生冷凝，不用担心消毒对象表面生成物乌洛托品形成白色粉末状残留下来，消毒完毕，无须用氨水中和，无须后续清洁，经短时间通风，甲醛气体被迅速排除，置换容易，停工时间短。c.甲醛与高锰酸钾 1:0.5 中和反应汽化：利用高锰酸钾的氧化能力使甲醛汽化灭菌，小型半无菌环境常采用。（2）石炭酸和乳酸混合液熏蒸消毒，适用于环境气体灭菌的方法，一般用商品石炭酸和乳酸（1
7、:1）混合液，通过甲醛熏蒸的三种装置之任一种，将上述混合雾化在目标环境中密闭 4h 以上时间，再用 2%的来苏尔或 0.1%苯扎溴铵溶液擦拭工作面。该方法的缺点是熏蒸后，工作面上结晶物较多，需再次清扫工作面，不适合全无菌环境。（3）气体灭菌的细菌挑战试验。为了确切证实药品制造环境气体灭菌效果，应对气体灭菌的每一个环节制定相应的规定，如应对气体灭菌时的室温、相对湿度、空气处于静止状态、灭菌过程时间，若用另一种药物中和，其中和时间、空气置换方式、废弃排放指标等一系列的因素进行固定确认，为了检验气体灭菌的最终效果，应进行指示菌的挑战试验。在气体灭菌中，细菌挑战试验一般采用每张细菌数量为 1106 个
8、枯草杆菌的试纸，置于目标环境中预先确定的位置，每个测点的培养皿中放置 2 张试纸，一张作气体灭菌后的无菌性试验，一张作灭菌后生菌数试验。试验结果的具体化验方法如下。气体熏蒸后，取一张试纸作无菌检查，用普通肉汤培养基在 37条件下，培养 72h，观察有无细菌生长。若有细菌生长，作生菌数量试验。在无菌条件下，将试验培养皿中剩下的一张含有 1106 个枯草杆菌的试纸放入 200ml 无菌生理盐水中，用 3000r/min 的搅拌机粉碎搅拌滤纸 5min，然后静止10min 后，取上清液 1ml 于普通肉汤琼脂平板培养皿中，在 37条件下，培养 72h 后检查生菌数X，取两个分样，报告生菌数为 X20
9、0/张，总数应少于 103/张。同时，作对照试验，取制备好的原始未灭菌的含有 1106 个枯草杆菌的试纸 2 张，一张作无菌性试验，一张作生菌数试验，条件同前，但是，作生菌数试验时应比前述再稀释 100 倍，结果应为50 个左右，即得出每张细菌含量 106 个。灭菌后的枯草杆菌试纸内残留的细菌数量少于 103 为合格，前述所有气体灭菌的各种条件都应以最终的细菌挑战试验的结果来设计调整。尤其要注意试验过程中，气体灭菌与空调系统的配合问题，若在灭菌与空气置换过程中，风量平衡未处理好，则容易造成暂时负压引起的灭菌后污染，影响试验的正确性。（4）灭菌效果验证。通过生物指示剂进行细菌挑战试验，确定甲醛或
10、戊二醛气体的发生量、灭菌时间、温湿度及操作方法。生物指示剂使用枯草杆菌，每张菌条含菌数量不小于 106，灭菌结果若非阴性则需作生菌数试验，确定熏蒸程序的灭菌效果，灭菌后含菌量应减少 3 个对数。（5）熏蒸灭菌后室内甲醛或戊二醛残余量的验证。用定量分析法测定室内甲醛或戊二醛残留量，室内残余浓度应0.0001%（对眼镜无刺激浓度） 。（6）冻干粉针剂车间甲醛熏蒸灭菌实例无菌操作区域（待灭菌区域）内培养皿放置位置的平面布置简图。试验采用的甲醛气化装置示意图。甲醛加热气化气体灭菌基本参数a.待验证无菌室的体积：150m 3。b.甲醛原液浓度：38%；密度： 1.1kg/L。c.室内甲醛浓度：25ml/
11、m 3。d. 室内温度：T=2530。e. 室内湿度： RH=60%。f.甲醛闷熏时间：46h。g.室内残余甲醛浓度：0.5g/g 以下。验证器材a.思锐高效消毒系统。b.不锈钢培养皿支架 8 个。c. 90 双碟玻璃培养平皿 8 个。d.枯草杆菌的试纸 28 张，每张试纸枯草杆菌含有数量为 1106 个。每个培养皿中放置两张试纸，一张作无菌性试验，一张作灭菌后的含菌数试验。e.干湿球温度计一个。f.温湿度记录仪一台。g.浓度为 40%的甲醛 3.7kg。灭菌过程室内环境控制参数a.无菌室内温度应在 5-30。b.无菌室内相对湿度为 70%以下。c.无菌室内甲醛浓度 7-15ml/ m3。d.
12、甲醛闷熏时间 2-4h。试验操作方法a.气体灭菌试验前，开启温湿度记录仪放入无菌室。b.关闭无菌室与外界联系的全部门和传递窗，并确认无菌室、调配室区域人员全部撤离。c. 关闭空调，将思锐超微雾化器置于指定位置。d. 在思锐专业消毒软件中输入待消毒空间的参数，如温度、湿度、空间大小等，软件自动计算出消毒剂的最佳配方，按配方要求在超微雾化器中加入纯化水、甲醛或其它消毒剂。e.启动超微雾化器，将消毒剂雾化为小于 7.5m 的超微雾滴（ dryfog 2） ，迅速散布至整个待消毒空间，并在常温下自然气化，确保消毒剂渗透至狭窄缝隙和多孔介质内，不留任何消毒死角。f. 无菌室内甲醛气体闷熏 2-4h 后。
13、i.最后开启空调器新风阀，关闭回风阀，开启值班风机，开启排风机。排除空间内残余甲醛气体后，无菌室内甲醛浓度应1g/g。j.人员更衣进入无菌区，取出无菌室放置的温湿度记录仪、枯草杆菌试纸玻璃培养皿，并封口送质检科对枯草杆菌试纸进行检验。（更多资讯敬请联系：广州市天河区思锐净化技术中心联系电话:020-87072435 13560240791 传真：020-87072435电子邮箱： 技术交流平台：http/ 1103 为合格验证试验。 气体灭菌细菌挑战试验结果统计表，见表 2。表 2 气体灭菌细菌挑战试验结果统计表无菌试验 残留细菌数样品序号枯草杆菌试纸设置位置 判断标准 结果 判断标准 结果
14、玻璃瓶出口 阳性 1000 个 灌装机台面 阳性 1000 个 冻干机门口 阳性 1000 个 无菌工艺走廊 阳性 1000 个 灭菌物暂存室 阳性 1000 个 轧盖上瓶间 阳性 1000 个 缓冲手消毒 阳性 1000 个 穿无菌衣 阳性 1000 个3.无菌制造环境空气中细菌含量的验证此项验证主要用于确定无菌室或半无菌室空气细菌的浓度，以测量沉降菌或直接抽取空气检测气体中细菌的方法来确定环境空气中的细菌情况。制造环境空气中细菌含量的验证过程如下：沉降菌验证试验内容如下。器材a.90 双碟培养皿。b.普通肉汤培养基。组分：胨 10g；氯化钠 5g；肉浸液 1000ml。取上述组分的胨、氯化
15、钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH 值使之能在灭菌后为 7.20.2，在 115的高压蒸汽下灭菌 30min，取出在净化工作台中分装入经过高压灭菌的培养皿中，每个培养皿中倒入 1520min 培养基，制成平板并用无菌牛皮纸包裹。测量方法。在缓冲间或传递窗中打开牛皮纸将培养皿传入待测环境，把盛有普通肉汤培养基的平板双碟培养皿放在指定的测点位置，揭开培养皿盖，将培养基暴露于空气中 30min，然后将培养皿盖上，放入恒温烘箱中，在 37温度条件下保温培养 72h，取出后镜检，计生长菌数。为了确定培养基中的污染情况，每次菌落测量均应对 12 个不开盖暴露在空气中的双
16、碟培养皿，进行上述培养，以排除在净化工作台中分装培养基时，可能由于空气质量问题造成的浮游细菌污染。验证试验目标环境中所需要的最少培养皿数目a.垂直或水平单向流装置控制范围（100 级（A/B ）条件下）14 个。b.10000 级（C 级）区域3 个。c.100000 万级（D 级）区域1 个。培养皿放置位置。按验证方案设计的图示位置放置，原则上应放置于各区域的重要操作位置。沉降菌试验细菌数量合格的标准a.100（A/B ）级无菌环境 1 个（每个90 平皿中的细菌沉降数） 。b.10000 级（C 级）3 个（每个 90 平皿中的细菌沉降数） 。c. 100000 级（D 级）10 个（每个
17、90 平皿中的细菌沉降数） 。4.无菌环境中使用的设备、工器具表面的细菌数验证（擦拭试验）该试验的目的是确定非最终灭菌的无菌药品制造过程的环境中无菌状况，因为无菌管理需要准确了解非最终灭菌的无菌药品其制造环境，通过各种灭菌方法综合处理后，在无菌空调系统的维持控制下，实际制造环境在无菌置信度是多大？擦拭试验方法如下。按验证设计中预定的无菌制造环境细菌数量的预设检查位置数量，准备足量的 55cm2 擦拭用取样签，用蒸馏水润湿后，放入玻璃试管中与操作用镊子一起，在 121的高温下灭菌 30min，取出待用。每日药品制造过程开始前，用无菌镊子从试管中夹出擦拭用取样签，对指定检查位置擦拭10cm10cm 的面积后，将擦拭用过的取样签头放入试管中塞上塞子待培养检验。此时的操作应特别注意，人手不能与取样签和试管口接触，以避免发生交叉污染。在无菌条件下，每个试管中倒入 15ml 普通肉汤培养基，放置于恒温箱中，在 37条件下，培养 7 天，应无细菌生长（即呈阴性反应） 。（更多资讯敬请联系：广州市天河区思锐净化技术中心联系电话:020-87072435 13560240791 传真：020-87072435电子邮箱： 技术交流平台：http/
