1、2010.3(总第158期） 山东食品发酵-3-Shandong Food Fermentation专题综述前言苹果酸又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体，广泛存在于多种水果和蔬菜中，因其在苹果中的含量最高而得名。由于苹果酸分子中有一个不对称碳原子，故有L-苹果酸、D-苹果酸和DL-苹果酸之分，自然界中广泛存在的是L-苹果酸。L-苹果酸为无色结晶或粉末，略带刺激性爽快酸味，酸感强度相当于柠檬酸的1.2倍左右，相对密度1.595，熔点100，易受潮，易溶于水，微溶于乙醇和醚，加热到180可失去水变成富马酸或马来酸。本文对L-苹果酸的应用、提取及发酵机理进行了简述。1 L-苹果
2、酸的用途1.1 L-苹果酸在食品工业上的应用L-苹果酸能模拟天然果实的酸味特征，味觉自然丰厚，可添加于饮料中作酸味剂，也可与甜味剂配合使用，主要用作加工和配制饮料、露酒、果汁，也用于糖果、果酱、果冻等的制造，L-苹果酸生产、提取及一步发酵法发酵机理研究（1.山东农业大学食品科学与工程学院 泰安 271018）（2.山东省食品发酵工程重点实验室 济南 250013）摘 要 L-苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，广泛分布于植物、动物与微生物细胞中，具有重要的生理功能，在食品、医药、日用化工等行业具有广泛的用途。研究表明，浆胞途径是产生L-苹果酸的主要途径，羧化酶在L-苹果酸的合成中起到关键
3、作用。关键词 L-苹果酸 提取 发酵机理郝夕祥1张家祥2田延军2刘建军1，2赵祥颖2L-malic acid s Production, Extraction and the Fermentation Mechanism s Research of One-step Fermentation HAO Xi-xiang1, LIU Jiang-jun1,2, ZHAO Xiang-ying2(1.College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian, 271018;)(2.Food & F
4、ermentation Engineering Key Lab of Shandong Province, Jinan, 250013)Abstract：L-malic acid is one important organic acid in process of organ ism metabolism, widely distributing in the cell of plant, animal and the microorganism, having important physiological function and having widespread use in the
5、 departments of food, medicine, everyday use chemical industry, and so on. The research shows that cytosolic pathway is the principal pathway of L-malic acid production and carboxylases play the crucial role in the L- malic acids synthesis. Keywords：L-malic acid, extraction, fermentation mechanism山东
6、食品发酵2010.3(总第158期）-4-Shandong Food Fermentation专题综述对食品且有抑菌防腐作用，可延长低盐香肠和果酱的保存期。亦可用于乳酸发酵pH值调节，葡萄酒酿造中除酒石酸盐等。1.2 L-苹果酸在烟草行业中的应用苹果酸衍生物（如酯类）能改善烟草香味。1.3 L-苹果酸在医药行业中的应用L-苹果酸可用于各种片剂、糖浆中可使其呈水果味，也是氨基酸注射液（手术后重要的营养药品）成分之一，以提高氨基酸的利用率，这对手术后虚弱和肝功能障碍病人尤其重要。它的钠盐是治疗肝功能不全，特别是高血压症的有效药物。L-苹果酸钠具有食盐的l/3盐味，可作肾脏病人代食盐及作为补铁、补锌
7、、补镁等药物，L-苹果酸钾是良好的钾补充药，它能保持人体水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚症等。美国FDA规定：婴儿不能服用DL-苹果酸，但可服用L-苹果酸。1.4 L-苹果酸在化学及其它工业上的应用苹果酸添加到虫胶清漆或其它清漆中，可防止漆面结皮；苹果酸生产的聚酯树脂和醇酸树脂是特殊用途的塑料。L-苹果酸在日用化工工业中可作为除臭剂和洗涤剂成分。还可用于牙膏配方、净牙片配方、合成香料配方等。2 L-苹果酸的生产方法L-苹果酸的生产经过人们的不断努力，已从早期单一的直接提取法发展到今天的多种生产方法。按生产原料的不同，大致可将L-苹果酸的生产分为5种：2.1 直接提取法1把石灰乳直接加入富含
8、L-苹果酸的果汁及蔬菜汁中，形成的L-苹果酸钙沉淀用硫酸处理，然后再回收游离的L-苹果酸。这种直接提取法由于果汁中含量相对较少，原料来源有限，生产成本很高，批量生产有困难，因此这一工艺应用局限性较大。2.2 化学合成法2将反丁烯二酸或顺丁烯二酸溶解于蒸馏水中，预热至50，放入高压釜中加热至180190，压力约为1MPa，反应8h后，降压降温至100以下，将反应物转入真空蒸发罐中，60浓缩至结晶析出，再经冷却、离心脱水、真空干燥得DL-苹果酸。用化学拆分手段，可将DL-苹果酸拆分获得L-苹果酸。2.3 利用微生物转化富马酸生产L-苹果酸1962年日本协和发酵公司北原觉雄申请的专利技术是用富马酸为
9、原料，在富马酸酶的作用下把富马酸转化为L-苹果酸。在我国，富马酸原料丰富，加上生产的方法比较成熟，因此我国的工厂采用此法生产L-苹果酸。到目前为止，筛选出来具有较高富马酸酶活性的菌种有短乳杆菌、 产氨短杆菌（ Brevibacterium ammoniagenes）、黄色短杆菌（ B. jlavum）、脱氮副球菌（ Paracocous denitrijicans）及温特曲霉（ A.wenri）等 。现在工业生产上多采用产氨短杆菌及黄色短杆菌含有的富马酸酶催化化学合成的富马酸一步转化生产L-苹果酸。采用的方法有固定化酶与固定化细胞两种。由于固定化细胞比固定化酶有着许多优点，其副反应可通过胆汁预
10、先处理固定化凝胶粒子得到解决，因此当前工业生产正朝着固定化细胞方向发展。深入的研究还表明，采用卡拉胶（ carrageenan）与聚乙烯亚胺（ polyethyleneimine）代替聚丙烯酰胺（ po1yacrylamide）等作为固定化细胞的凝胶载体，可减少毒性，提高固定化细胞中富马酸酶的活性，使固定化细胞半衰期寿命得到延长，相对生产能力增加数倍。 目前日本采用此法的转化率已高达98以上。2.4 利用微生物发酵糖质原料生产L-苹果酸采用此法的生产途径有两条：第一条是用单一菌种一步发酵生产L-苹果酸。所用的菌种有黄曲霉（ A.flavus）、寄生曲霉（ A. parasiticus）、米曲霉
11、（ A.oryzae）、裂褶菌、胶质干朽菌（ Merulius tremellosus）及出芽短梗霉（ Aureobasidium pullulans）等；第二条是混种发酵两步生产L-苹果酸。首先采用少根根霉（ Rhizopus ahirrizus）或华根霉（ R.chinensis）把糖质原料转化成富马酸，然后利用膜醭毕赤酵母（ pichiamembRanaef-aciens）、普通变形杆菌（ Proteus vulgaris）及宛氏拟青霉（ Paecilomyces varioti）之一，把富马酸转化成L-苹果酸。由于发酵周期较长，产酸率相对较2010.3(总第158期） 山东食品发酵-5
12、-Shandong Food Fermentation专题综述低、副产物较多，因 此直到目前为止还尚未见有应用于大规模工业生产的报告。2.5 利用微生物发酵非糖质原料生产L-苹果酸目前人们已成功地采用布伦假丝酵母（ cbrumptii IFO 0731 ） 发酵正构石蜡（ nparaffins），宛氏拟青霉AHU9417、9254及8007发酵乙醇、甘油、醋酸及丙酸等，类产碱菌（ Alcaligenes spT50 I ）发酵马来酸，其转化率分别达80 、48% 及98.4% 。但这些非糖质原料发酵生产L-苹果酸目前仍处于实验室阶段，尚未投入工业生产。3 L-苹果酸的提取工艺3.1 从发酵醪液
13、中提取L-苹果酸的工艺流程为：发酵液酸解过滤滤液中和过滤沉淀酸解过滤滤液精制浓缩结晶干燥成品3.2 操作方法为：3.2.1 在发酵醪液中边搅拌边加入硫酸，调pH1.5左右；3.2.2 过滤除去沉淀，滤液中加碳酸钙，直到不再有CO2放出，此时生成苹果酸钙；3.2.3 用石灰乳调pH7.5，静置68h；3.2.4 过滤，收集苹果酸钙沉淀，并用少量冷水洗去沉淀中的残糖和其他可溶性杂质；3.2.5 加入近一倍量的温水，搅拌成悬浊液，加入硫酸，调pH1.5左右，搅拌30min，静置数小时，石膏渣沉淀充分析出；3.2.6 过滤，得粗制苹果酸溶液，其中含有微量富马酸、Fe2+、Ca2+、Mg2+和色素；3.
14、2.7 从联合柱流出的高纯度苹果酸溶液，在70减压浓缩到苹果酸浓度为65%80%，冷却至20，添加晶种析晶；3.2.8 晶体于4050下真空干燥，得苹果酸成品。4 L-苹果酸的生物合成途径L-苹果酸在生物体内的合成途径如图1所示， 有三条合成途径3： 一是丙酮酸羧化或磷酸烯醇式丙酮酸羧化， 此涉及到CO2的固定； 二是支路乙醛酸循环； 三是延胡索酸由延胡索酸酶转化生成苹果酸。图1 L-苹果酸的合成途径几十年来，人们对L-苹果酸在微生物中的代谢途径进行了研究，尤其对裂褶菌（ Schizophyllum commune）代谢途径的研究比较深入。目前从事这方面工作的研究者大都认为CO2固定反应是L-
15、苹果酸生成及积累的重要途径。其证据有3个：（1）在糖质原料培养基中，必需有CaCO3才能使L苹果酸有效地积累起来。（2）把-H14CO3加入或把14CO2通人培养基中，发酵后14C 主要集中于L一苹果酸及L一天门冬氨酸中。（3）生物素、丙酮酸及磷酸烯醇丙酮酸（PEP)对L一苹果酸的合成具有促进作用。此外，O.Pine4等采用13C-核磁共振方法研究酿酒酵母积累L-苹果酸的代谢途径，结果表明L-苹果酸主要由丙酮酸草酰乙酸L-苹果酸产生，此途径又成为浆胞途径（ Cytosolic pathway）5。Y.Peleg6等将1-13C标记的葡萄糖用于黄曲霉 Aspergillus flavus Kyo
16、wa A-114（ ATCC 13967）产L-苹果酸的研究，发现同位素标记只出现在L-苹果酸的C3上，在一定程度上也证实了浆胞途径。丙二酸是TCA循环中琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，包永明7等研究指出，在摇瓶发酵的培养基中添加不同浓度的丙二酸对R30菌株发酵苹果酸无明显效果，这间接说明TCA循环在R30菌株L-苹果酸积累过程中并不占主要地位。图2 CO2固定途径山东食品发酵2010.3(总第158期）-6-Shandong Food Fermentation专题综述注：Glu：葡萄糖；PEP：磷酸烯醇丙酮酸；Pyr： 丙酮酸；OAA： 草酰乙酸；FA： 富马酸；PC：丙酮酸羧化酶；PEPC：
17、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；PCK：磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶；ME：苹果酸酶； MDH： 苹果酸脱氢酶； SDH： 琥珀酸脱氢酶。图2所示，曲霉N1-14在发酵L-苹果酸过程中，其胞质中有活跃的PC、PEPC、PCK、ME、MDH和SDH等多种酶的活性，周小燕8研究指出，其中三种羧化酶的活性与胞质蛋白量（CP）和L-苹果酸产生速率（RL）之间都存在很好的正相关关系，尤其是PC，伴随着胞质蛋白量波动14.5倍，L-苹果酸产生速率波动5.6倍，PC酶活力波动13倍。表明胞质中羧化酶类合成的增多或减少是其酶活力增强或减弱的重要原因，从而引起L-苹果酸生成速度加快或减慢，所以，曲霉N1-14胞质中羧化酶蛋白分
18、子的合成是产生L-苹果酸的重要机制。5 L-苹果酸一步发酵法存在的问题及对策一步发酵法生产L-苹果酸由于某些因素的限制并未大规模应用于工业生产，其中主要的问题是伴有其它杂酸如柠檬酸的产生。传统的方法已不能解决这一难题。应用现代生物技术改变微生物L-苹果酸的合成系统已经迫在眉睫。代谢途径控制与优化的出现，解决了这一难题。采用代谢工程的方法重新设计代谢网络来提高目的代谢物的产量。采用计算机工具进行代谢流分析（ metabolic flux analysis，MFA ）使得估计细胞内的代谢流成为可能，这种方法也能够用来描述在特定基因环境条件下的代谢特征，因此可以操控特定的基因来提高目的物的产量。So
19、o Yun Moon采用代谢流分析的方法提高大肠杆菌的苹果酸产量。模拟结果表明把允许的磷酸烯醇式丙酮酸羧化流放大能提高苹果酸的产量。因为大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶把磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸，而不产生ATP，因而失去了磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸键。磷酸烯醇式丙酮酸激酶能在转化中产生ATP而被使用。然而，大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶能催化草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸，却不能催化想要的相反反应。所以，作者克隆了 Mannheimia succiniciproducens 的磷酸烯醇式丙酮酸激酶（由 pckA基因编码）， Mannheimia succiniciproducens 的磷酸烯醇
20、式丙酮酸激酶能以理想的速率催化磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸。大肠杆菌的pta突变株WGS-10含有包括 M. succiniciproducens pckA基因的 p104ManPck质粒，WGS-10被重新构建。WGS-10在37培养12小时，L-苹果酸的浓度为9.25g/L。6 L-苹果酸的前景及展望L-苹果酸属于发酵生产的产品，安全性有保障，因此国际市场上需求量快速增加，近年来需求量保持年均10%左右高速度增长。L-苹果酸发酵使用的原料为山芋粉、木薯干、玉米等淀粉质原料或工业用葡萄糖、甘蔗及废糖蜜。在我国，这类原料丰富且廉价，与其他方法相比，发酵法生产L-苹果酸的利润可观。相信在不久的将来
21、，随着国家对发酵行业的大力支持，发酵法生产L-苹果酸的前景是乐观的。参考文献1刘建军，姜鲁燕等.L-苹果酸的应用及研究进展J.中国食品添加剂，2003,3:5356.2 王博彦，金其荣.发酵有机酸生产与应用手册M.北京：中国轻工业出版社, 2000:541567.3 刘建龙，刘建军等.酶转化法及微生物发酵法生产L-苹果酸的研究进展J.中国酿造，2005,7:58. 4O.Pines,S.Even-Ram,et al.The cytosolic pathway of L-malic acid synthesis in Saccharomyces cerevisiae: the role of f
22、umarase J.Appl Microbiol Biotechnol,1996,46:393399.5 G.T.Tsao,N.J.Cao,J.Du,C.S.Gong,Production of multifunctional organic acids from renewable resources,Adv.Biochem. Eng.Biotechnol.1999,65:243280.6 Yoav Peleg,Ayla Barak,Michael C et al.Malic acid accumulation by Aspergillus.flavus,.13C-NMR and isozyme analyses J.Appl Microbiol Biotechnol,1989,30:176183.7 包永明，严复.少根根酶发酵糖质原料积累L-苹果酸的生物化学J.大连轻工业学院学报，1994,13(02):6571.8 周小燕，吴清平等.曲霉N1-14胞质酶活性与产L-苹果酸能力的关系J.微生物学报，2000,40(05):500506.9 J.E.Bailey,Towards a science of metabolic engineering J, Science,1991,252:16681674.
