1、基因与疾病,基因组(genome) 泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。,一、基因与基因组学概念,基因就是DNA分子上的一个个片段，经过转录和翻译能合成一条完整的多肽链。,基因 (gene),基因结构与表达异常与疾病,人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。,人体内蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因 。,基因结构与表达异常与疾病,细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多
2、的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。,现在已知道的遗传性疾病约有6000种，其中单基因缺陷疾病占30%，多基因缺陷疾病占70%。多基因缺陷疾病包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、内分泌疾病、自身免疫系统疾病等。如我国高血压患者占人口11%，约30%有家庭遗传背景，其中4种为单基因突变，多数为多基因疾病，与30多个基因有关。老年性痴呆、耳聋、精神病也都与基因缺陷有关。经过对数千名孪生者研究证明：武断个性60%源于遗传背景，幸福愉快感80%源于遗传背景，XXY男性有暴力倾向。分子遗传学家认为，这些研究进展揭示：人群的致病危险大小、人群的个性特征与行为举止与人的基因有一定的关系。,
3、一、基因病的概念,以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致分为三类： （一）单基因病 （二）多基因病 （三）获得性基因病,家族性结肠息肉（familial polyposis coli, FPC),又称为家族性腺瘤样息肉病（familial adenomatous polyposis, FAP ），是一种常染色体显性遗传病，由它恶变导致的癌症占所有结直肠癌的1%。该病在人群中的发病率为1/10000 1/8000。,1991年研究人员从5q21克隆了家族性腺瘤样息肉病基因，即APC基因。该基因含有15个外显子，
4、编码2843个氨基酸的蛋白质。APC基因具有肿瘤抑制基因的功能。,Benign(良性),恶性,Tumor,Carcinoma 癌,Sarcoma 肉瘤,Leukemia 白血病,Cancer (癌症),Cancer Etiology,Multiple Carcinogen,Cancer: Three Characteristics,growth,differentiation,death,Poor,Fast,Decreased cell death,、multiple stages,Treatment,Multiple factors,Cancer,Characteristics of can
5、cer,一、基因结构与表达异常与疾病发生,1基因结构改变,2细胞间信号异常,3 细胞内因素,在自然界中有许多因素可以引起DNA结构的改变。虽然细胞内具有修复DNA损伤的功能，但并非所有的损伤都能被修复。一些未能修复的损伤有可能形成可遗传的突变。如果突变是发生在结构基因中，将使基因编码的蛋白质发生结构改变，失去原有的功能，导致分子病的发生。,基因变异致病类型,内源基因的变异:基因结构突变:镰状红细胞贫血 基因表达异常:肿瘤,外源基因的入侵: 乙肝， 艾滋病等（病毒）,二、 基因结构异常的分子机制,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变（mutation）,在复制过程中发生的DNA突
6、变称为 DNA损伤（DNA damage）,从分子水平来看，突变就是DNA分 子上碱基的改变。,是指体内代谢过程中产生的自由基或某些环境因素引起的DNA一级结构改变。,引起DNA一级结构改变的原因主要有两类：,自发突变 （spontaneous mutation）,诱发突变 （induced mutagenesis）,这种突变频率极低，约为10-9，即每合成109核苷酸可能会有一次碱基与模板不相配的错误。,是指DNA复制时碱基的偶然性错配。,DNA一级结构变异的分子机制,1碱基和核苷酸类似物,（一）诱变因素,2烷化剂,3亚硝酸盐,4电离辐射和紫外线照射,(二)、突变类型及其遗传效应,突变类型,
7、1. 点突变,2. 缺 失,3. 插 入,4. 倒 位,突变的遗传效应,1. 遗传密码的改变,2. 对mRNA剪接的影响,3. 蛋白质肽链中的片段缺失,1. 遗传密码的改变,（1） 错义突变,（2） 无义突变,（3） 同义突变,（4） 移码突变,DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变，这种突变称为错义突变。,错义突变（missense mutation）：,G A A C T T,G A A,G T A C A T,G U A,缬氨酸,碱基取代引起的错义突变,DNA,mRNA,氨基酸,无义
8、突变（nonsense mutation）：,由于碱基的取代，使原来可翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子，这被称为无义突变。,UAU,UAA,颠 换,（酪氨酸）,（终止密码子）,在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质，即所谓移码突变。,移码突变（frame-shifting mutation）：,无论是哪一种形式，都可导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物。,mRNA前体：,剪 接,mRNA,2. 对mRNA剪接的影响,无义突变,DNA片段的缺失,造成蛋白质肽链中
9、片段缺失的原因：,移码突变,移码突变不仅使翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。因为移码使阅读框发生改变后，在结构基因中往往会出现多个终止密码子，无法翻译出全长的肽链。,3. 蛋白质肽链中的片段缺失,着色性干皮病 （xeroderma pigmentosum，XP）,XP是一种核苷酸切除修复缺陷所致的疾病，已经发现7个基因与之相关。这7个基因均与DNA的切除修复相关，不同XP患者的临床表现与涉及的具体基因及突变类型有关。,(一）基因突变导致蛋白质功能改变,多肽链合成正常 各级结构正常 亚细胞定位和分拣正常 多聚体形成正常 与辅助因子或辅基结合正常 稳定性正常,三、基因
10、突变导致蛋白质功能改变,（1）正常蛋白质功能实现所需的条件,（2）基因突变对蛋白质功能的影响水平,基因突变影响mRNA合成，间接影响蛋白质合成,影响多肽链的折叠和结构 基因突变影响蛋白质（多肽链）亚细胞水平的定位 基因突变影响亚单位组装和多聚体形成 基因突变影响辅基或辅助因子与肽链的结合或去除 基因突变影响蛋白质的稳定性,原发因素：基因本身； 继发因素：调节因子、修饰等,原发因素/ 继发因素,A B,基因突变影响 hnRNA 的剪接,基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。,第二节
11、基因变异导致的常见疾病,一 遗传学疾病 （一）单基因遗传病以-地中海贫血为例介绍单基因变异导致的遗传病-地中海贫血是因珠蛋白链的合成明显减少或完全不能合成导致.珠蛋白基因结构简单,只有1.8KB长,含有3个外显子,2个内显子,编码146个氨基酸,-地中海贫血的基因缺陷,主要由于点突变或移码突变所致,突变对基因表达的影响大致分为6种类型:1. 转录水平降低2. RNA剪接异常,3. 翻译缺陷4. RNA修饰缺陷5. 生成不稳定的珠蛋白6. 基因缺失引起的地中海贫血,苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）,遗传学一种严重的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，首次发现于1934年，因病人尿
12、中排泄大量的苯丙酮酸而得名。国外发病率约1/45001/100,000，我国发病率约为1/16500。疾病基因已定位于12q24.1并已被克隆。,发病机制PKU患者PAH基因突变使患者肝脏内苯PAH缺乏，苯丙氨酸不能转变为酪氨酸，只能转化为苯丙酮酸和苯乳酸并在体内累积，并导致血液和尿液中苯丙氨酸及其衍生物排出增多。,苯丙氨酸,酪氨酸,-羟苯丙酮酸,尿黑酸,延胡索酸,乙酰乙酸,PHA,尿黑酸氧化酶,PKU,Alkaptonuria,过量的苯丙氨酸使旁路代谢活跃，产生苯丙氨酸、苯乳酸、苯乙酸等，它们从尿液和汗液排出，使患儿的头发、皮肤和尿均有特殊气味。,过量的苯丙氨酸抑制酪氨酸脱羧酶的活性，影响去
13、甲肾上腺素和肾上腺素的合成，也减少黑色素的合成，使患者毛发和肤色较浅,过量的苯丙氨酸竞争性的抑制色氨酸羟化作用影响色氨酸的代谢。此外，旁路代谢产物堆积还抑制L-谷氨酸脱羧酶的活性，使氨基丁酸和5-羟色胺生成减少，导致脑发育障碍。,临床表现,34个月智力发育不全。 脑电图异常，骨骼发育异常，门齿疏松。 有较严重的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，虹膜颜色减退。 尿、汗有特殊腐臭,治疗目前临床上常在婴儿出生后立即进行PKU的筛查，一经肯定，立即给患儿停乳，喂给低苯丙氨酸水解蛋白，禁荤食、乳类、豆类和豆制品，可以达到临床痊愈。,(二）多基因遗传病,糖尿病是一种异质性疾病。分为原发型和继发型两种。原发型分为胰
14、岛素依赖性(IDDM)和非胰岛素依赖性(NIDDM).NIDDM是多个遗传因子与环境因子共同作用的结果，包括：（1） 胰岛素基因 （2） 胰岛素受体基因(3) 葡萄糖激酶基因（4） 糖原合酶基因（5） 线粒体tRNA基因,遗传性胰岛素抵抗糖尿病,受体合成障碍 受体向胞膜运输受阻 受体与胰岛素亲和力降低 受体活性降低 受体降低加快,胰岛素受体基因突变,靶细胞对胰岛素反应性降低(型糖尿病),二、 神经系统疾病,以老年性痴呆为例来说明神经系统疾病的发生与基因变异的关系。AD是一种复杂的基因病,通过基因分析已确定有三种导致 早发性AD发病的基因,它们分别位于1,14和21号染色体,而晚 发性AD发病的
15、遗传危险因素位于19号染色体.(一)淀粉样前体蛋白(APP)基因APP是一种广泛存在于全身组织细胞的糖蛋白,正常情况 下,APP由分泌酶裂解为可溶性A.基因突变或其他因素可 以导致APP氨基酸序列或裂解部位的改变,从而产生易于沉淀 的A.,(二)早老素基因(PS)APP基因的突变所致AD仅占FAD的2%3%.而大多数 AD的病因为PS基因的突变.PS1基因与70%80%的早发AD有关,突变类型包括错义突变和剪切位点突变.PS2基因突变家族AD发病较晚.(三)载脂蛋白E(ApoE)基因ApoE的等位基因4与晚发AD相关联。,三、 肿 瘤,癌基因的激活，抑癌基因的丢失或失活均会引起肿瘤的发生，发展
16、。（一）癌基因激活与肿瘤的发生 1.ras基因变异与肿瘤发生2.myc基因变异与肿瘤发生3.bcl-2基因与肿瘤发生4.mdm2基因,growth,differentiation,death,(二)抑癌基因失活与肿瘤发生以p16为例说明抑癌基因失活与肿瘤发生的关系p16基因:又称为多肿瘤抑制因子,编码细胞周期依赖性激酶CDK4的抑制蛋白,p16蛋白既是细胞周期的有效调控者,又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子.正常情况下,cyclinD和p16对CDK4的作用处于平衡状态,当p16基因异常时,cyclinD则与CDK4以优势结合,使细胞生长失去控制.,视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,
17、RB）,遗传性恶性肿瘤,RB1基因共有27个外显子，长180kb。RB1蛋白由928个氨基酸组成，是一种磷酸化蛋白。,Retinoblastoma autosomal dominant inheritance,Paediatric tumour of the retina 1/20,000 births two forms of the disease familial and sporadic,Due to mutations in the Retinoblastoma (Rb) tumour suppressor gene,The RB1 Gene,Large gene spanning
18、27 exons, with more than 100 known mutations. Greater than 200kb of DNA in size RNA is 4.7 kb Gene encodes Rb protein which is involved in cell cycle regulation,Adapted from Sellers W et al. J Clin Onc 15:3301, 1997,DP,E2F,DNA synthesis-related genes,E2F,E2F,P,P,P,P,(三)肿瘤发生中的多基因协同作用,一种肿瘤的发生,往往同时存在多种
19、遗传缺陷.目前普遍接受的是细胞癌变的多基因协同假说。该假说认为细胞癌变是多步骤，多重影响的复杂过程。且这种基因之间协同效应的产生并非是两种癌基因之间的随机组合。而是符合一定的规律。核内癌基因产物最易与胞浆癌基因产物发生协同作用。,（3）基因突变对蛋白质功能影响的效应,基因突变导致蛋白功能丢失 数量降低 结构丧失导致活性丧失 基因突变导致蛋白功能加强 结构改变导致活性增强 数量增加 基因突变导致蛋白产生新的特征或功能,Fast,二、疾病相关基因的鉴定,（一）检测人类基因变异或突变 （二）疾病时基因组差异表达分析 （三）染色体制图定位及疾病相关基因克隆,第 一 节 基 因 诊 断 Genetic
20、Diagnosis,一、 基因诊断的概念及常用技术,患者临床表现：中医的望闻问切与西医的影像学检查 细胞形态、生化检测及免疫学检验：生命活动的结构和物质基础,Concept of Gene Diagnosis,基因诊断的概念,基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断,狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。,基因诊断的概念,特点 针对性强 特异性强 灵敏度高 适应性强,一、基因诊断的概念和特点,定义 利用现代
21、分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。,基因诊断（gene diagnosis）,是检测DNA或RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。,基本原理,临床意义,对疾病作出早期、确切诊断,确定个体对疾病的易感性,疾病的分期分型,疗效监测,预后判断,一、基因诊断中常用的分子生物学技术,（二）聚合酶链式反应（PCR）,（三）单链构象多态性检测,（四）限制酶酶谱分
22、析,（五）DNA序列测定,（六）DNA芯片技术,（一）核酸分子杂交,（一）基因突变的诊断,1. 点突变的诊断,2. 少数核苷酸缺失或插入的诊断,3. 大片段丢失或插入的诊断,4. 基因重排（染色体易位）的诊断,5. 基因扩增的诊断,（1）诊断已知的点突变,（2）诊断未知的突变,二、基因诊断的基本方法,PCR/ASO探针法,（ allele specific oligonucleotide ，ASO）,等位基因特异性寡核苷酸,DNA芯片,诊断已知的点突变：,PCR 反应,PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO，PCR-DB)ASO: Allele Specific Oligo
23、nucleotide1). wild probe vs mutant probe 2).已知突变的验证性检测3).可区分纯合子和杂合子,1. 诊断已知的点突变,寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交,引物1,引物2,5,5,PCR,PCR,多重PCR法,3. 大片段丢失或插入的诊断,提取基因组DNA,PCR,基因片段扩增,特定限制酶酶切,分析酶切后产物分子的有无、大小，判断是否有疾病基因。,电泳,（设计引物）,person A,person B,5 A3 3 T5,5 G3 3 C5,DNA多态性：,在人群中，个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA多态性。,（二）多态性分析
24、,能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点，但片段长度变化还可以由其它原因引起。,RFLP的产生有两种情况：,1：位点多态性,在限制酶识别位点发生单个碱基置换，导致这 一多态性位点的丢失或获得，称为位点多态性。,由于限制酶识别位点之间的DNA序列缺失、插入或重复，限制酶的识别序列不发生改变，但它在基因组中相对位置发生了变化。,2：片段多态性,人类基因的基因内或旁侧序列存在许多重复序列（如微卫星DNA、小卫星DNA等），由于重复单位的数目不同而形成多态性，即DNA重复序列多态性。,DNA重复序列多态性,小卫星 DNA是由924bp为重复单位的串联重复顺序构成，总长度约为0 .120kb
25、，重复次数变化很大（从数次到数百次）。分布于所有染色体，往往位于近端粒处，个体间的差异很大。,微卫星DNA是由15bp为重复单位的寡核苷酸串联重复序列构成，总长度常小于150bp，重复次数1060次左右。存在于内含子、间隔DNA中，也可以存在于编码区。,若显示与正常人不同的杂交条带，据此诊断疾病。,1) .,选用特定限制酶,酶切DNA,特异探针,Southern印迹杂交,+,提取基因组DNA,1. 限制性片段长度多态性分析,（1）限制酶酶切图谱直接分析法,2. PCRRFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出
26、诊断。用于已知突变位点的验证性诊断,2) .,提取基因组DNA,PCR,基因片段扩增,特定限制酶酶切,分析酶切后产物分子的有无、大小，判断是否有疾病基因。,电泳,（设计引物）,RFLP-Restriction Fragment Length Polyhmorphism,RLFP分析法,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,限制酶酶切图谱直接分析法：,分析点多态性,分析缺失、插入或重组引起的多态性
27、,诊断疾病基因结构多态性变异已经明确的疾病,人类基因组的位点多态性和串联重复顺序多态性都是按孟德尔规律遗传的， 具有体细胞稳定性和种系稳定性，因此可用它们作为染色体上疾病基因座位的遗传标记。用于检测疾病基因的携带者，产前诊断。在法医学上可用于个体（罪犯）鉴定以及亲子鉴定等。,PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。 1）单链核酸碱基-构象-电泳速率 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR/单链构象多态性分析 (single strand con
28、formation polymorphism, SSCP) PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。,PCR-SSCP分析原理示意,正常人,纯合突变,杂合突变,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,+,（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术,例：四色荧光自动测序分析结果,（四）外源DNA检测,生物芯片（biochip &bioarray)技术：根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。,疾病诊断芯片,个性化用药芯片,例：基因
29、芯片杂交结果,（三）基因表达异常的诊断,1. mRNA的相对定量分析,2. mRNA的绝对定量分析,3. mRNA长度分析,（1）斑点杂交或狭缝杂交：,DNA芯片检测的差异表达谱,第五节 肿瘤的基因诊断,策略一：易位染色体和融合基因检测,如T细胞受体基因TCR与IgH重排后，原先间隔数百bp的V区和J区靠近，通过扩增片段长度判断是否重排,从表达某一特定基因的组织中提取总RNA,（2）RT-PCR法：,PCR,cDNA片段,吸光度扫描计算出相应的RNA含量,32P-dCTP,PCR,dNTP,测定放射性活度推算出mRNA的含量,逆转录,制备RNA样品,逆转录,电泳及定量分析,PCR,待测基因引物
30、,参照引物（-actin 等）,cDNA第一链,内参照引物,-actin,待测样品,一、遗传性疾病基因诊断,二、感染性疾病基因诊断,三、肿瘤基因诊断,四、法医学鉴定,第五节 肿瘤的基因诊断,策略二：癌基因和抑癌基因检测,如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密码子130290之间的基因突变,第五节 肿瘤的基因诊断,策略三：病毒癌基因检测,多种DNA或RNA病毒感染与肿瘤相关,第五节 肿瘤的基因诊断,策略四：肿瘤标志物检测,tumor marker: 肿瘤组织产生的、与肿瘤发生发展相关的物质，如肿瘤抗原、激素、酶等。,第六节 感染性疾病的基因诊断,通过对不同病源微生物遗传物质DNA或RNA的检测展开,三、基因诊断的应用,遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定,THE END,THANK YOU,
