1、银杏叶中银杏黄酮树脂分离对比实验近年来近年来 ,整个世界特整个世界特 别别 是西方是西方 发发 达国家掀起了一达国家掀起了一 阵绿阵绿 色浪潮。国 际际 上上 渐渐渐渐 形形成了一种共成了一种共 识识 -得自得自 绿绿 色生命色生命 (植物植物 )的的 产产 品往往具有品往往具有 较较 大的安全性。大的安全性。 银银 杏作杏作 为为 近近代植物代植物 药药 开开 发发 研究的研究的 热热 点之一点之一 ,正正 处处 于于 这这 一浪潮的前沿。一浪潮的前沿。银银 杏杏 树为银树为银 杏科植物杏科植物 银银 杏杏 (Ginkgo biloba.L.)又名公又名公 孙树孙树 ,为为 我国特我国特 产
2、产 植物植物 .银银杏叶提取物杏叶提取物 (GRE)主要含黄主要含黄 酮酮 ,内内 酯酯 两两 类类 活性成分活性成分 ,黄黄 酮酮 以山柰酚以山柰酚 (kaempferal),槲皮槲皮素素 (quercetin),异鼠李素异鼠李素 (isorhamnetin)的的 甙类甙类 化合物化合物 为为 主主 ,内内 酯酯 以白果内以白果内 酯酯 及及 银银 杏杏内内 酯酯 A.B.C(gimkgolide A.B.C)为为 主。 银银 杏黄杏黄 酮酮 具有捕具有捕 获获 游离基游离基 ,抑制血小板活化抑制血小板活化因子因子 (PFA)扩张扩张 冠冠 动动 脉血管脉血管 ,增加心增加心 脑脑 血量等功
3、效。可用于治血量等功效。可用于治 疗疗 由于血管老化由于血管老化 ,脑脑血管供血不足所血管供血不足所 导导 致的外周循致的外周循 环环 不良不良 ,眩眩 晕晕 ,耳耳 鸣鸣 ,头头 痛失眠痛失眠 ,短期短期 记忆记忆 不良听力障不良听力障碍碍 ,精神不振等精神不振等 ,同同 时时 ,还还 可以用于研制可以用于研制 营营 养口服液养口服液 ,保健食品与化保健食品与化 妆妆 品品 ,其其 应应 用日益用日益广泛有关广泛有关 银银 杏提取方法杏提取方法 报报 道很多道很多 ,德国首先提出德国首先提出 银银 杏制杏制 剂剂 含量的含量的 质质 量量 标标 准准 :黄黄 酮酮 糖糖甙甙 24% 萜萜 内
4、内 酯酯 6%和白果酸和白果酸 210-6。为为 了是了是 银银 杏杏 产产 品能出口品能出口 创汇创汇 ,参加国参加国 际际 市市场场 的大循的大循 环环 ,不断探索新的提取方法工不断探索新的提取方法工 艺艺 ,研究并研究并 选择选择 出出 简单简单 且高效的工且高效的工 艺艺 方法以方法以成成 为这为这 个个 领领 域的焦点。目前有关银杏叶的提取工艺主要以乙醇为提取溶剂，我们以银杏黄酮和内酯为目标， 对其银杏黄酮、内酯进行了正交提取工艺 研究，确定了最佳提取工 艺，本次实验用最佳提取工艺得到的提取液进行大孔吸附树脂吸附分离对比实验研究，以期为银杏叶银杏黄酮 、内 酯大孔吸附树脂分离找到最合
5、适的树脂， 为银杏叶银杏黄酮的开发利用提供科学依据。1 材料与仪器1.1 材料 银杏叶(采自陕西略阳)，自然干燥，粉碎。1.2 试剂 银杏黄酮对 照品( 含量98%)：购自 Sigma 公司; 银杏内酯对照品(含量98%) ：购自 Sigma 公司;大孔树脂 LX-38C、D101，DM130 购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。试剂均为分析纯。1.3 仪器 电热恒温水浴锅(HHS21-6C，上海医疗器械五厂); 电子分析天平(FC204，上海精科 实业有限公司);UV -762 紫外可见 分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);旋转蒸发器(上海亚蓉生化仪器厂);SHZ-D()循环水式真空泵，
6、索式提取器，电热鼓风干燥箱;植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)2 方法2.1 银杏叶银杏黄酮、银杏内酯的薄层检测银杏叶银杏黄酮的薄层检测硅胶薄板制作称取 4g 硅胶 G 置于研钵中，加入 0.5%的羧甲基 纤维素钠溶液 12ml，研磨15min 后铺于 2010cm 的干 净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。展开剂配制取展开剂 氯氯 仿仿 -甲醇甲醇 -乙酸乙乙酸乙 酯酯 按按 2：1：1 的比例配制 60ml（30：15：15）作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在 105下活化 30min。点样：点样点距板子底端 1.5cm 左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能
7、向中间靠拢，每个点样点点样约 20l，点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约 0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约 1.5cm 时取出板子，自然晾干。观察：展开取出晾干后， 喷喷 5%AlCl3 的乙醇溶液，的乙醇溶液， 热风热风 吹干、并在 365nm 荧荧 光灯下光灯下观观 察。Rf 。银杏叶银杏内酯的薄层检测硅胶薄板制作称取 4g 硅胶 G 或硅胶或硅胶 GF254 置于研钵中，加入 0.5%的羧甲基纤维素钠溶液 12ml，研磨 15min 后铺于 2010cm 的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。展开
8、剂配制取展开剂 甲苯甲苯 -丙丙 酮酮 按按 7：3 的比例配制 50ml（35：15）作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在 105下活化 30min。点样：点样点距板子底端 1.5cm 左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能向中间靠拢，每个点样点点样约 20l，点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约 0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约 1.5cm 时取出板子，自然晾干。观察： 先先 喷细喷细 水水 雾雾 定位后定位后 170加加 热热 30 分分 钟钟 ，若有 银银 杏内杏内 酯酯 存在，在波 长长 254nm下
9、出下出 现苍现苍 黄色黄色 荧荧 光斑点， 银银 杏内杏内 酯酯 B 的的 Rf=0.23 左右。2.2 络络 合分光光度法合分光光度法 测测 定定 银银 杏黄杏黄 酮酮 的含量的含量a. 标标 准曲准曲 线线 的制的制 备备精确秤取芸香叶精确秤取芸香叶 甙甙 rutin（芦丁） 30mg，用 30%乙醇溶液溶解并定容至乙醇溶液溶解并定容至100ml（含量 为为 0.30mg/ml）分 别别 吸取吸取 标标 准液准液 1、3、5、7、9ml 于于 25ml 容量瓶中，用容量瓶中，用30%乙醇乙醇 补补 充至充至 12.5ml,加入加入 0.7mlNaNo2(1:20),摇摇 匀，放置 5 分分
10、 钟钟 后，加入0.7mlAl(No3)3(1:20),6 分分 钟钟 后加入后加入 5ml 1mol/L 的的 NaoH 溶液并溶液并 摇摇 匀匀 ,用用 30%的乙的乙醇醇 补补 充至刻度充至刻度 线线 ,10 分分 钟钟 后于后于 510nm 进进 行比色行比色 测测 定。用用 UV-265 可可 记录记录 分光光度分光光度 计测计测 定定 结结 果如下果如下 毫升毫升 0 1 3 5 7 9浓浓 度度 值值 (mg/ml) 0 0.012 0.036 0.060 0.084 0.108OD 值值b.样样 品的制品的制 备备 及及 测测 定定准准 备备 称取称取 2 克克 银银 杏叶粉碎
11、至粉末杏叶粉碎至粉末 ,放置于索氏提取管中。加放置于索氏提取管中。加 约约 150ml 甲醇甲醇 热热回流至回流液无色，减回流至回流液无色，减 压浓缩压浓缩 至小体至小体 积积 、定容至 150ml，摇摇 匀待匀待 测测 ，从中移取 5ml到到 25ml 中的容量瓶中，按中的容量瓶中，按 标标 准曲准曲 线线 的的 测测 定方法加定方法加 样样 ，并用 UV-265 紫外分析紫外分析 仪仪测测 定其定其 浓浓 度。精确精确 产产 品品 50mg，用 30%乙醇溶液溶解并定容至乙醇溶液溶解并定容至 100ml。结结 果果标标 准曲准曲 线线 如下如下 : 测定结果：用 LX-38C 、D101，
12、DM130 大孔吸附树脂进行 银银 杏黄杏黄 酮酮分离对比实验A 树脂处理1.准确称取 20gNaoH,慢慢加入到盛有 300ml 蒸馏水的烧杯中溶解，稀 释至500ml，配成 4%的 NaoH 溶液。将新 购 LX-38C 、D101，DM130 大孔吸附树脂约300g 置于其中，其间不断进行搅拌，冷浸 3h,之后用蒸馏水洗至中性。2.精确量取 15ml 盐酸，慢慢加入到盛有 300ml 蒸馏水的烧杯中溶解，稀释至500ml，配成 3%HCL 溶液。加入上步处理后的树脂，冷浸 3h,搅拌，之后用蒸馏水洗至中性。备用。3.树脂的再生：做过实验的树脂用 4%的 NaoH 溶液冷浸 3h,之后用蒸
13、馏水洗至中性备用。B 银杏叶 样样 液液制备水提 称取银杏叶 100g，加 1000ml 自来水煮提 120 min，用 4 层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入 700ml 自来水煮提 90 min，用 4 层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入 700ml 自来水煮提 90 min，用 4 层纱布粗滤得粗滤液，合并 3 次粗滤液。再重复 2 次，300g 银杏叶粗滤液合并， 量取体积，得银 杏叶样液（ g/ml），平均分成 3 份，备用。醇提 称取银 杏叶 100g，加 600ml 75%酒精浸泡 30min 后超声提取 30min，用 4层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入 500ml75%酒精超声提取 3
14、0min，用 4 层纱布粗滤得粗滤液，合并两次粗滤液，在重复 2 次，300g 银杏叶粗滤液合并，减压浓缩至无醇味，加 65温水至 1200 ml 进行水沉，静置过夜，次日， 滤液于 LD5-10离心机中离心，3000r/min,15min ，离心后合并上清液。下层为油状膏子保留备检，上层过滤液定容至 1200 ml，得银杏叶样液（ g/ml），平均分成 3 份，备用。C LX-38C 大孔吸附树脂分离 银银 杏黄杏黄 酮酮1.将处理后树脂，装入 4.538.0cm 柱中，上 样，平均流速 3-5ml/min，流出液收集，取其 10ml 留样，冰箱保藏。2.用蒸馏水以平均流速 5-8ml/min 进行洗涤，洗至无色。3.经层析柱后，被树脂吸附物质即为银杏黄酮。用 8 ml/ min 的流速，用 2000ml 75%酒精洗脱，洗脱液收集，取其 10ml 留样，冰箱保藏。洗脱液减压浓缩回收酒精至无醇味。6.继续浓缩至浓液，倒于蒸发皿中，于 50真空干燥箱中干燥，得黄色物 质 g。LX-38C g。D101 g。DM130 g。F 实验结果和分析实验结果1. 银银 杏黄杏黄 酮酮、银杏内酯的薄层定性检测2. 银银 杏黄杏黄 酮酮、银杏内酯的含量测定分析
