1、WB 问题总结Q1：两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平 ? 1）玻璃没有洗干净。2) 过硫酸铵和 TEMED 的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。4) 稍微注意手法，均匀加入。5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许 AP 来增加边缘胶的凝聚强度。7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到 50 度的温箱，由于
2、受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。Q2：胶为什么总是漏？1） 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。2) 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。3) 关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4) 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5) 下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。6) 玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电
3、泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。 （注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。 ）7) 可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8） 因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9） 先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了
4、。Q3：条带跑得比正常的窄？1） 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀. 2） 可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3） 可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。4） 常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。5） 有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。Q4：为什么会有“微笑”和“倒微笑 ”这样的效果呢？1） “微笑“是因为灌胶的时候冷却不
5、均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。 “倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象2） 书上说出现 “微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑” 可能是因为两端的胶凝的不好，加 APS 和 TEMED 后应该混合均匀。3） 样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高Q5：Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办？1:）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗
6、，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2:）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3:）倒胶的时候，用 1ml 的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！4:）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快 ，而且不容易产生气泡，不妨试试5:）用双蒸水封时建议用 200ul 的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起
7、来！6:）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7:）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜 5-10 度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8:）还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。Q6：背景过高1:）封闭不全。 2:）一抗或者封
8、闭液与膜蛋白的交叉反应。3:）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4:）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。5:）膜或者缓冲液污染6:) 膜没有完全浸润7:) 封闭时间的控制8:) 洗膜没有洗干净9:) 显色Q7：杂带多1） 杂蛋白多，目的蛋白经处理后有变化2） 抗体特异性不强3） 降低一二抗孵育时间和浓度4） 增加洗涤次数5） 合理的封闭方法6） 确认二抗与样本抗原有无交叉反应7） 减少底物显色时间和曝光时间Q8：无目的条带1） 电泳时间短，与相近分子量蛋白未分开2） 蛋白有无表达3） 可能转膜是转出4） 上样少5） 抗体浓度6） 目的蛋白被裂解7） 发光液和显影液的问题8
9、） 缩短封闭时间和洗涤时间9） 胶的浓度的选择Q9：大分子量蛋白不好转到膜上1） 膜的孔径太小2） 转膜电压电流太低3） 转膜时间太短4） 可能是胶浓度太大Q10：转膜后为白板1） 转膜时，胶与膜放返2） 转膜时间、电流或者电压太高3） 抗体浓度和抗体的选择4） 洗脱时间太长5） 电泳时间太长IHC 问题总结Q1：边缘效应?1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸） ，切出尽量薄的组织切片，不厚于 4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边
10、缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘 3-4mm。Q2：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3） 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织） ，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫
11、血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5） DAB 孵育时间过长或浓度过高；6） PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；7） 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？1） 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。 不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。2） 抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火 4 次*6min 试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。3
12、） 组织切片本身这种抗原含量低；4） 血清封闭时间过长。5） DAB 孵育时间过短。6） 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。7） 开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。Q4：背景强的原因?1） 考虑一抗浓度高；2） 然后调整 DAB 孵育时间；3） 也要考虑血清封闭时间是否过短4） 适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。Q5：石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？1） 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度2） 用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做3） 有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，
13、冲到组织上方，让它流下冲洗组织，4） 用高温修复时，温度骤冷也可能引起。Q6： 一抗从 4 度拿出后，为什么要进行 37 度复温？1） 一方面，防止切片从 4 度直接放入 PBS 易脱片；2） 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4 度和 37 度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。Q7：切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：1） 抗体浓度过高：一抗浓度过高是
14、常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。2） 抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。3） DAB 变质和显色时间太长：DAB 最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出
15、氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。4） 组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用 DAKO笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。5） 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于 24 小时）：原
16、因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4C 冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。6） 一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 Q8：脱片产生的原因有哪些？1） 多聚赖氨酸玻片质量的问题。2） 组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3） 没烤好，时间短，温度不够之类。4） 操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌
17、疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。5） 修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进 100 度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到 EDTA 的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。6） 一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用 PBS 的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。7） 组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。 Q9：DAB 显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？1） 切出的片子厚度本身可
18、能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。2） 有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。3） 如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘 0.5 cm。Q10：染色过强 1） 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）2） 孵育温度过高，3） DAB 显色时间过长或 DAB 浓度过高，显色时间不能超过 5-10 分钟，以显微镜下观察为准Q11：非特异性背景染
19、色 1）操作过程中冲洗不充分2）组织中含过氧化物酶未阻断 ，可再配置新鲜 3%H2O2 封闭，孵育时间延长 3）组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭 4）血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间 Q12：染色弱1） 抗体浓度过低，孵育时间过短 ，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于 60 分钟2） 试剂超过有效使用期 及时更换试剂3） 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）4） 室温太低，低于 15 若室温低于 15 度，要改放在 37孵育箱孵育 30-60 分钟（或4冰箱过夜）5） 蛋白封闭过度，封闭时间不要超过 10 分钟Q13：染色阴性1） 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 2） 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 3） 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误
