1、- 1 -大棚甜瓜病虫害拮抗微生物的选育摘要：针对大棚甜瓜生产过程中日益严重的病害问题，病害的微生物筛选出相应的拮抗菌通过生物间的竞争作用、拮抗作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发植物抗病性等，来抑制某些病虫害的繁殖和活动，以达到生物防治的目的。一引言甜瓜作为我国主要的传统果瓜品种之一。近年来，随着栽培技术的改进，主要以大棚栽培为主。大棚甜瓜栽培中虫害较少，但病害发生种类多且危害严重。大棚中温度、湿度高，病害严重，普遍发生的病害有：霜霉病、白粉病、枯萎病、炭疽病、蔓枯病、细菌性角斑病、灰霉病。农户通常使用的化学杀菌剂主要有：杀毒矾、速克灵、甲基托布津、多菌灵、农用链霉素、代森锰锌、百菌清、普力
2、克等。大棚甜瓜坐果期普遍具有病害发生频率高、范围广、病害多样性及严重性的特点 ，通常对病害的防治平均每 37 天喷施农药一次。大量农药的使用不但对生态环境及作物生长有极大的危害，农产品的农药残留已严重危害人们的健康，因此，无公害、绿色安全的农产品生产技术越来越受到人们的重视。同时，由于在生产过程长期大量使用化肥、农药，作物生态环境严重恶化，作物营养供给不足，严重影响作物正常生长，自身对各种病虫害的抗性能力减弱，高毒农药的大量使用使各种病虫害的天敌减少，病虫害抗药性增加及其发病频率日益增多，产品农药残留的污染日渐严重，已严重影响产业发展、产品外销以及威胁到人们的身体健康和经济农业的可持续发展。类
3、似情况在大棚蔬菜、各类水果、茶叶等其他经济作物的生产过程中均普遍存在，已严重的威胁到人们的身体健康和经济农业的可持续发展。生物防治技术是通过选育对人类健康安全可抑制或杀灭植物病原菌的特殊微生物，经培养施加于作物栽培环节，达到代替化学农药防治作物病害的目的。生物防治技术的原理主要是利用各种有益的微生物，通过生物间的竞争作用、拮抗作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发植物抗病性等，来抑制某些病虫害的繁殖和活动，以达到生物防治的目的。生物防治具有许多优于化学防治的特点，如生物防治重在提供一个良好的- 2 -植物生长环境，增加植物自身对病虫害的抗性，避免病原菌的侵染与扩散，抑制病虫害对植物产生危害，对人
4、畜安全，不污染环境，不产生抗药性，仅杀伤或抑制防治对象，能参与生态环境的调控，保持生态平衡，起到长效的作用。因此在农业生产上急需开发新型高效拮抗微生物菌剂以替代化学农药。1. 大棚甜瓜生产中的主要病害1.1 甜瓜白粉病症状为此病主要侵染叶片、叶柄、茎蔓也可受害，果实受害小。发病初期叶面产生白色粉状小霉点，不久扩大成一片白粉层。1.2 甜瓜蔓枯病甜瓜枯萎病是甜瓜生产中严重病害之一，常造成大片瓜田植株死亡。它是由土壤（营养液）侵染，从根、根茎部侵入维管束后而寄生的系统性病害。典型症状是萎蔫，瓜类生长的全生育期都能发病，但以抽蔓到结果期发病最重。播种后可以造成烂种，苗期造成子叶或全株萎蔫，茎基部变褐
5、缢缩，呈猝倒状。发病最多在植株开花座果期，发病初期，植株表现为叶片从基部向顶端逐渐萎蔫，中午尤其明显，早晚尚可恢复，数日原植株全部叶片萎蔫，不再恢复常态，茎蔓基部稍缢缩，表皮粗糙，常有纵裂，病部在潮湿时，根茎部呈水渍状腐烂，表面常产生白色或粉红色霉状物。1.3 甜瓜疫病甜瓜疫病高温高湿易发病，特别是在雨后，发病快，来势猛，短短几天瓜秧全部死亡。症状为发病初期茎基部呈暗绿色水渍状，病部渐渐溢缩软腐，呈暗褐色，患病部叶片萎蔫，不久全株枯死，病株维管束不变色。2.大棚甜瓜病害防治相状国内在大棚甜瓜病害的防治上主要有农业防治法、化学防治法、生物防治法。但是国内在生物防治领域还比较落后，鲜见生物防治菌剂
6、的使用，仍主要采用较为传统的农业防治加化学防治模式。具体地防治方法：选用耐病品种，培育壮苗，加强管理。防治白粉病用25粉锈宁可湿性粉剂 2000 倍液或 50%DT 可湿性粉剂 500 倍液喷洒；霜霉病用 25甲霜灵 600 倍液、70代森锰锌 800 倍液、40乙膦铝 200 倍液、0.3波尔多液喷洒叶面；枯萎病播前可用 70甲基托不津可湿性粉剂 8001000 倍液浸种，定植时用 50多菌灵 500 倍液或 70甲基托不津 1000 倍液灌根防治。- 3 -用一遍净（吡虫啉）10002000 倍，扑虱灵 5001000 倍喷雾防治蓟马和蚜虫。长时间大量使用化学农药已造成严重的后果：(1)与
7、过量摄入化学农药有关的疾病发病率逐步升高，人、畜中毒的现象严重。(2)植物病虫害的耐药性种群增加；(3)自然农业生态系统的平衡被破坏。而生物防治主要是利用各种有益的微生物，通过生物间的竞争作用、拮抗菌作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发抗病性等，来抑制某些病原物的存活和活动。据研究，拮抗菌的作用机制主要包括如下五个方面：产生抗生素，拮抗蛋白的拮抗作用，溶菌作用，竞争作用，寄生作用等。生物防治具有许多优于化学防治的特点，如显著改善作物生长环境，对人畜安全，不污染环境，不产生抗药性，仅杀伤或抑制防治对象，参与生态环境的调控，保持生态平衡，起到长效的作用。生物防治具有无残留无污染，不杀伤天敌，不会(
8、或较少) 产生抗药性，有利于人畜安全及环境保护，成本低，兼防兼治，增产增收等优点，是一种无公害植保新技术，有利于农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益，发展前景广阔。二正文(一)实验材料1.1 样品的采集采集了陕西、青海、上海四省市的温室土样、大田土样、生活垃圾、牦牛粪、蚯蚓粪、发酵牛粪等样品源，为了方便，本文对各样品地进行了编号，见下表。 符号 样品（Samples）Mht 陕 西 眉 县 猕 猴 桃 大 田Pg 陕 西 富 平 苹 果 大 田Fp 陕 西 富 平 甜 瓜 大 棚 ， pH为 6.5SL 上 海 生 活 垃 圾QM 青 海 牦 牛 粪- 4 -QF 陕 西 源 县
9、蚯 蚓 粪SF 上 海 发 酵 牛 粪1.2 病原菌编号（No.） 菌 名（Name） 备 注（Remark）1 甜瓜蔓枯病病原菌 病 原 菌 接 种 于 PDA 斜 面 ,于 4 冰 箱 中 保 存 。1.3 培养基1.3.1 细 菌 分 离 用 培 养 基牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 （ Beef Extract Peptone Medium） ： 牛 肉 膏 3g， 蛋 白 胨 10g， NaCl 5g， 琼 脂 15-20g， pH 7.0-7.2， 水 1000ml。阿 须 贝 培 养 基 （ Ashby Medium） ： KH2PO4 0.2g ， CaCO3 5.
10、0g， MgSO47H2O 0.2g， C6H14O6 10.0g， NaCl 0.2g， CaSO42H2O 0.1g， pH 7.0， 水 1000ml。无 机 磷 培 养 基 *： C6H12O6H2O 10g， (NH4)2SO4 0.5g， NaCl 0.3g， KCl 0.3g， MgSO47H2O 0.3g， FeSO47H2O 0.03g， MnSO44H2O 0.03g， Ca3(PO4)2 5g， pH 7.0 7.5。有 机 磷 培 养 基 *： C6H12O6H2O 10g， (NH4)2SO4 0.5g， NaCl 0.3g， KCl 0.3g， MgSO47H2O
11、0.3g， FeSO47H2O 0.03g， MnSO44H2O 0.03g， CaCO3 5g， 卵 磷 脂 0.2g， pH 7.0 7.5。硅 酸 盐 细 菌 培 养 基 *： C12H22O11 5.0g， Na2HPO4 2.0g， MgSO47H2O 0.5g， FeCl3 0.005g， CaCO3 0.1g， 玻 璃 粉 1.0g， pH 7.0。*NY 227-94 微 生 物 肥 料 中 规 定 的 培 养 基 。1.3.2 放 线 菌 分 离 用 培 养 基高 氏 一 号 合 成 培 养 基 （ Gauses No 1 Synthetic Medium） ： KNO3 1
12、.0g， FeSO47H2O 0.01g， KH2PO4 0.5g， 可 溶 性 淀 粉 (先 加 少 量 冷 水 调 成 糊 状加 入 ) 20.0g， MgSO4.7H2O 0.5g， NaCl 0.5g， pH 7.2 7.4。 临 用 时 在 已 融 化- 5 -的 高 氏 1号 培 养 基 中 加 入 重 铬 酸 钾 溶 液 ， 以 抑 制 细 菌 和 霉 菌 生 长 。 每 300mL培养 基 中 加 3 重 铬 酸 钾 1mL(100mg/kg)。1.3.3 丝 状 真 菌 分 离 用 培 养 基马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （ Potato Dextrose Ag
13、ar Medium， PDA） ： 马 铃薯 200g， 葡 萄 糖 20g， 琼 脂 15-20g， pH自 然 ， 水 1000ml。察 氏 培 养 基 （ Czapek S Medium） ： 硝 酸 钠 3g， 磷 酸 氢 二 钾 1g， 硫 酸镁 (MgSO47H2O) 0.5g， 氯 化 钾 0.5g， 硫 酸 亚 铁 0.01g， 蔗 糖 30g， 琼 脂 20g， 蒸 馏 水 1000mL， 121灭 菌 20min。马 丁 培 养 基 ： KH2PO4 1.0g， C6H12O6H2O 10.0g， MgSO47H2O 0.5g， 蛋白 胨 5.0g， 1 孟 加 拉 红 水
14、 溶 液 3.3mL。1.3.4 细 菌 鉴 定 用 培 养 基硝 酸 盐 还 原 试 验 培 养 基 ： 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 液 1000ml， KNO3 1g， pH 7.0-7.4， 121 灭 菌 20min。淀 粉 水 解 试 验 培 养 基 ： 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 中 ， 加 入 0.2%的 可 溶 性淀 粉 ， 121 灭 菌 20min。V.P（ 乙 酰 甲 基 甲 醇 ） 试 验 培 养 基 ： 蛋 白 胨 5g， 葡 萄 糖 5g， NaCl 5g，蒸 馏 水 1000ml， pH 7.0-7.2， 112 灭 菌 20min。耐 盐 性
15、 试 验 培 养 基 ： 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 液 中 分 别 加 入 2%、 5%、 7%、 10%浓度 的 NaCl， 121 灭 菌 20min。吲 哚 产 生 试 验 培 养 基 ： 牛 肉 膏 3g， 胰 蛋 白 胨 10g， NaCl 5g， 水 1000ml， pH 7.0-7.2， 121 灭 菌 20min。纤 维 素 分 解 试 验 培 养 基 ： 无 机 盐 基 础 培 养 基 （ NH4NO3 1.0g， CaCl2 0.1g， K2HPO4 0.5g， FeCl3 0.02g， KH2PO4 0.5g， MgSO47H2O 0.5g， NaCl 1.0g，
16、酵 母 膏 0.05g， 水 1000ml， pH 7.0-7.2， 121 灭 菌 20min） ； 胨 水基 础 培 养 基 （ 蛋 白 胨 5g， NaCl 5g， 水 1000ml， pH 7.0-7.2， 121 灭 菌20min） 。糖 醇 类 发 酵 试 验 培 养 基 ： （ NH4） 2HPO4 1g， MgSO47H2O 0.2g， KCl 0.2g， 酵 母 膏 0.2g， 糖 或 醇 类 10g， 水 洗 琼 脂 5-6g， 蒸 馏 水 1000ml， 0.04%溴- 6 -百 里 香 酚 蓝 酒 精 液 20ml， pH 7.0-7. 2， 112 灭 菌 20min
17、。H2S产 生 试 验 培 养 基 ： 蛋 白 胨 20g， NaCl 5g， 柠 檬 酸 铁 胺 0.5g， 硫 代硫 酸 钠 0.5g， 琼 脂 15g， 蒸 馏 水 1000ml， pH 7.2， 121 灭 菌 20min。柠 檬 酸 盐 的 利 用 试 验 培 养 基 ： 柠 檬 酸 钠 2g， NaCl 5g， MgSO47H2O 0.2g， （ NH4） 2HPO4 1g， 1%溴 百 里 香 酚 蓝 水 溶 液 10ml， 琼 脂 20g， 蒸 馏 水 1000ml， pH 6.8-7.0， 112 灭 菌 20min。pH5.7营 养 肉 汤 培 养 基 ： 蛋 白 胨 10
18、g， 葡 萄 糖 20g， 蒸 馏 水 1000ml， pH 5.7， 112 灭 菌 20min。酪 素 水 解 试 验 培 养 基 ： 50ml鲜 牛 奶 离 心 脱 脂 ， 另 1.5g琼 脂 溶 于 50ml蒸 馏水 中 ， 将 两 液 分 开 灭 菌 ， 冷 至 50 时 ， 将 两 液 混 匀 倒 平 板 。好 氧 性 试 验 培 养 基 ： 牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 。1.3.5 放 线 菌 鉴 定 用 培 养 基高 氏 一 号 培 养 基 (Gauses No.1 Medium )。马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 （ PDA） 培 养 基 。葡 萄 糖 蛋 白
19、 胨 酵 母 膏 培 养 基 (Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY)： 蛋 白胨 5克 ， 酵 母 膏 3克 ， 葡 萄 糖 2克 蒸 馏 水 1000ml， pH 7.0 7.2， 112 灭 菌30min。克 氏 一 号 琼 脂 培 养 基 (Kliglers No.1 Medium)： K2HPO4 0.25克 、 MgCO3 0.075克 ， NaCl 0.5克 ， KNO3 0.25克 ， FeSO4 0.00025克 ， CaCO3 0.125克 ， 葡萄 糖 5克 ， 琼 脂 4克 ， 水 250ml， pH 7.2-7.4， 112
20、 灭 菌 30min。马 铃 薯 块 (Potato block)： 新 鲜 马 铃 薯 洗 净 去 皮 ， 切 成 斜 条 ， 水 浸 半 小时 ， 然 后 装 入 试 管 ， 试 管 内 应 先 放 脱 脂 棉 球 ， 并 注 入 水 ， 水 面 应 高 出 棉 球 ， 达到 马 铃 薯 块 基 部 ， 121 灭 菌 30min。1.3.6真 菌 鉴 定 用 培 养 基马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 （ PDA） 培 养 基 。1.3.7试 剂 与 染 液革 兰 氏 染 色 ： 草 酸 胺 结 晶 紫 混 合 液 ， 卢 哥 氏 碘 液 ， 95%乙 醇 ， 0.5%的 番 红- 7 -
21、O复 染 液 。芽 孢 染 色 ： 5%孔 雀 绿 水 溶 液 ， 0.5%番 红 水 溶 液 。硝 酸 盐 还 原 试 验 ： 格 里 斯 氏 A液 ： 对 氨 基 苯 磺 酸 0.5g， 稀 醋 酸 150ml； B液 ： -萘 胺 0.1g， 蒸 馏 水 20ml， 稀 醋 酸 150ml。V.P试 验 ： 40%NaOH， 肌 酸 。H2O2试 验 ： 4% H2O2。吲 哚 产 生 试 验 ： 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 5g， 95%乙 醇 75ml， 浓 盐 酸 25ml。乳 酸 石 炭 酸 棉 蓝 染 色 液 ： 石 炭 酸 10g， 乳 酸 （ 比 重 1.21） 1
22、0ml， 甘 油 20ml， 蒸 馏 水 10ml， 棉 蓝 （ cotton blue） 0.02g， 将 石 炭 酸 加 在 蒸 馏 水 中 加 热溶 解 ， 然 后 加 入 乳 酸 和 甘 油 ， 最 后 加 入 棉 蓝 ， 使 其 溶 解 即 成 。以 上 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 。 分 子 学 试 剂 如 连 接 酶 、 聚 合 酶 、 T载 体 及 各 种试 剂 盒 等 购 自 天 根 生 化 有 限 公 司 。1.4 实验器材仪 器 型 号 厂 家 显 微 镜 Eclipse E200尼 康 公 司 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅 LDZX-40BI型 海 申 安
23、 医 疗 器 械 厂超 净 工 作 台 SP-DJ型 中 国 上 海 浦 东 物 理 光 学 仪 器 厂电 热 恒 温 干 燥 箱 GZX-DH400-BS-II型 上 海 跃 进 医 疗 器 械 厂霉 菌 培 养 箱 MJ-160-II型 上 海 跃 进 医 疗 器 械 厂 电 子 天 平 sartoriusBS210S型 北 京 赛 文 利 斯 天 平 有 限 公 司(二)实验方法2.1 细菌、放线菌和丝状真菌的分离每 份 样 品 称 取 10.0g， 研 碎 ,于 无 菌 条 件 下 加 入 到 90ml无 菌 水 中 摇 动 均 匀 ，取 其 上 清 液 稀 释 成 合 适 （ 10-
24、5、 10-6、 10-7） 的 浓 度 梯 度 ， 然 后 通 过 常 规 的 稀释 法 或 划 线 法 接 种 于 相 应 的 细 菌 分 离 培 养 基 上 。 若 分 离 芽 孢 杆 菌 则 先 将 梯 度液 在 100 水 浴 加 热 10分 钟 ， 以 杀 死 不 产 芽 孢 的 细 菌 和 其 他 菌 类 ； 高 氏 一 号 培养 基 中 一 部 分 加 入 重 铬 酸 钾 ， 其 最 适 浓 度 为 150mg/L。 细 菌 培 养 于 37 培 养 1天 ,丝 状 菌 30 培 养 5天 ， 挑 选 菌 落 形 态 差 异 比 较 明 显 的 菌 落 ， 重 复 划 线 接
25、种- 8 -于 相 应 的 琼 脂 平 板 上 ,直 至 纯 化 得 到 单 菌 落 ， 然 后 转 接 于 相 应 的 琼 脂 斜 面 上 , 待 进 行 拮 抗 实 验 。2.2 广谱拮抗菌的初筛和复筛采 用 PDA平 板 对 峙 生 长 法 初 筛 ： 以 1病 原 菌 为 指 示 菌 ， 在 平 板 中 央 点 接 病原 菌 ， 待 病 原 菌 生 长 2天 或 5天 （ 菌 落 直 径 约 1-1.5cm） 时 ， 将 接 入 初 筛 的 菌 株 ，点 接 距 平 板 中 央 2.5cm处 的 6或 4或 3个 角 点 上 ， 以 不 点 接 初 筛 菌 株 为 对 照 ， 置于 2
26、8 培 养 箱 培 养 3-5天 ， 观 察 记 录 病 原 真 菌 的 生 长 情 况 。 选 出 对 上 述 病 原 菌生 长 有 相 对 较 强 抑 制 作 用 的 菌 株 进 入 复 筛 。采 用 平 板 对 峙 生 长 法 进 行 复 筛 ： 具 体 操 作 同 上 ， 以 12种 病 原 菌 分 别 为 指示 菌 ， 拮 抗 平 板 培 养 5天 或 10天 后 ， 分 别 测 量 相 关 数 据 ， 并 记 录 R值 （ R=病 原菌 与 拮 抗 菌 的 菌 丝 边 缘 距 /拮 抗 菌 中 心 到 病 原 菌 菌 丝 边 缘 的 距 离 ） ， 根 据 R值的 大 小 ， 筛
27、选 出 具 有 广 谱 拮 抗 作 用 的 、 抑 菌 效 果 好 的 、 拮 抗 作 用 持 久 的 菌 株 ，用 于 后 续 研 究 。 2.3 拮抗细菌的形态鉴定2.3.1 个体形态的观察革 兰 氏 染 色 ： 采 用 10-14小 时 菌 龄 的 菌 种 进 行 染 色 。 经 涂 片 、 初 染 （ 草 酸胺 结 晶 紫 染 液 ） 、 媒 染 （ 卢 哥 氏 碘 液 ） 、 脱 色 （ 95%乙 醇 ） 、 复 染 （ 番 红 O酒精 液 ） 。 镜 检 结 果 是 紫 色 菌 体 的 为 G+， 红 色 菌 体 为 G-。芽 孢 染 色 ： 常 规 涂 片 后 ， 用 饱 和 的
28、 孔 雀 绿 水 溶 液 染 10分 钟 ， 自 来 水 冲 洗 ，风 干 后 用 0.5%番 红 液 复 染 1分 钟 ， 水 洗 ， 吸 干 。 镜 检 结 果 芽 孢 呈 绿 色 ， 菌 体 和芽 孢 囊 呈 微 红 色 。测 量 菌 体 大 小 ： 用 测 微 尺 对 革 兰 氏 染 色 涂 片 进 行 菌 体 大 小 的 测 量 ， 每 个菌 株 须 测 量 10个 以 上 菌 体 的 宽 度 和 长 度 ， 求 其 平 均 值 。扫 描 电 镜 观 察 ： 样 品 制 备 方 法 是 采 用 离 心 洗 涤 ， 将 菌 体 依 次 固 定 及 脱 水 ，即 将 样 品 置 于 1%
29、-2%戊 二 醛 磷 酸 缓 冲 液 （ pH7.2左 右 ） 中 ， 于 4 冰 箱 中 固 定 过夜 。 次 日 以 0.15%的 同 一 缓 冲 液 冲 洗 ， 用 40%、 70%、 90%和 100%的 乙 醇 分 别 依次 脱 水 ， 每 级 15min。 脱 水 后 ， 用 醋 酸 戊 脂 置 换 乙 醇 。 将 制 备 的 样 品 置 于 临 界点 干 燥 器 中 ， 浸 泡 于 液 态 二 氧 化 碳 中 ， 加 热 到 临 界 点 温 度 （ 31.40， 72.8个 大- 9 -气 压 ） 以 上 ， 使 之 气 化 进 行 干 燥 。 然 后 将 样 品 放 在 真 空
30、 镀 膜 机 内 喷 金 ， 取 出样 品 在 扫 描 电 镜 中 进 行 观 察 。2.3.2 菌落形态的观察将 菌 种 划 线 接 种 于 平 板 上 培 养 24小 时 ， 观 察 记 录 单 菌 落 的 形 态 和 特 征 ：菌 落 形 态 （ 圆 形 不 规 则 形 、 菌 丝 体 状 、 根 状 扩 展 等 ） ， 菌 落 质 地 （ 表 面 光 滑 、湿 润 、 干 燥 、 皱 褶 等 ） ， 菌 落 边 缘 （ 整 齐 、 缺 刻 状 、 波 状 、 裂 叶 状 等 ） ， 光 学特 性 （ 透 明 、 半 透 明 、 不 透 明 ） ， 菌 落 的 颜 色 和 是 否 分 泌
31、 可 溶 性 色 素 等 。2.3.3 生理生化鉴定过 氧 化 氢 酶 反 应 ： 取 一 干 净 的 载 片 ， 其 上 滴 一 滴 4%的 过 氧 化 氢 ， 挑 取 一环 培 养 20小 时 的 菌 苔 ， 在 过 氧 化 氢 溶 液 中 涂 抹 ， 若 有 气 泡 出 现 则 为 阳 性 ， 反 之为 阴 性 。糖 或 醇 类 发 酵 试 验 ： 取 20小 时 的 幼 龄 待 测 拮 抗 菌 种 ， 直 针 穿 刺 接 种 于 糖醇 类 发 酵 培 养 基 中 ， 37 培 养 1、 2、 4、 7天 或 14天 后 观 察 结 果 。 指 示 剂 有 绿色 变 黄 表 示 糖 类
32、发 酵 产 酸 。 琼 脂 柱 中 若 有 气 泡 出 现 ， 则 表 示 产 气 。 本 试 验 同 时还 可 观 察 运 动 性 。V.P试 验 ： 取 待 测 拮 抗 菌 种 一 环 ， 接 种 于 V.P培 养 基 （ 5ml） 中 ， 37 培 养四 天 后 ， 取 培 养 液 （ 1ml） 和 等 量 的 40%NaOH相 混 合 ， 加 少 量 （ 约 0.500mg）的 肌 酸 ， 充 分 振 荡 后 ， 若 培 养 液 出 现 红 色 ， 则 为 V.P阳 性 ， 有 时 需 要 放 置 更 长时 间 或 加 热 以 加 速 反 应 进 行 。 培 养 7天 后 用 酸 度
33、计 测 定 培 养 液 的 pH值 。淀 粉 水 解 试 验 ： 取 待 测 拮 抗 菌 种 点 接 于 淀 粉 培 养 基 平 板 上 ， 每 皿 6个 菌 株 ，37 培 养 3天 ， 形 成 菌 落 后 ， 在 平 板 上 滴 加 卢 哥 氏 碘 液 ， 以 铺 满 菌 落 周 围 为 度 ，平 板 呈 蓝 色 ， 菌 落 周 围 如 有 无 色 透 明 圈 出 现 ， 则 说 明 淀 粉 已 被 水 解 。柠 檬 酸 盐 的 利 用 试 验 ： 取 幼 龄 待 测 拮 抗 菌 种 接 种 于 柠 檬 酸 盐 培 养 基 斜 面 上 ，37 培 养 3天 ， 培 养 基 呈 碱 性 （
34、蓝 色 ） 者 为 阳 性 反 应 ， 不 变 色 者 （ 绿 色 ） 为 阴性 。酪 素 水 解 ： 将 待 测 拮 抗 菌 株 点 接 于 牛 奶 平 板 上 ， 37 培 养 1、 3、 5天 ， 记录 菌 落 周 围 和 下 面 酪 素 是 否 已 被 分 解 而 呈 透 明 。硝 酸 盐 还 原 试 验 ： 取 待 测 拮 抗 菌 一 环 ， 接 种 于 硝 酸 盐 液 体 培 养 基 （ 5ml）- 10 -中 （ 需 做 对 照 管 ） ， 37 培 养 1、 3、 5天 。 取 干 净 的 试 管 倒 入 培 养 液 ， 然 后 分别 滴 加 一 滴 试 剂 A液 和 B液 ，
35、 对 照 组 中 同 样 加 试 剂 。 如 果 培 养 液 中 出 现 粉 红 色 、玫 瑰 红 色 、 橙 色 或 棕 色 时 ， 表 示 有 亚 硝 酸 盐 存 在 ， 为 硝 酸 盐 还 原 阳 性 。 如 无 相应 颜 色 出 现 时 ， 滴 加 二 苯 胺 试 剂 ， 如 呈 蓝 色 反 应 ， 则 表 示 培 养 液 中 仍 有 硝 酸 盐存 在 ， 如 不 呈 蓝 色 反 应 ， 表 示 硝 酸 盐 和 新 形 成 的 亚 硝 酸 盐 都 已 还 原 成 其 他 物 质 ，仍 按 硝 酸 盐 还 原 阳 性 处 理 。耐 盐 性 试 验 ： 将 幼 龄 拮 抗 菌 （ 一 环
36、） 接 种 于 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 液 （ 5ml）中 （ 该 培 养 液 可 配 成 不 同 的 盐 浓 度 ， 如 2%、 5%、 7%、 10%等 ） ， 培 养 基 要 求 十分 澄 清 ， 需 做 对 照 管 ， 目 测 拮 抗 菌 的 生 长 情 况 。在 pH5.7营 养 肉 汤 上 的 生 长 ： 取 待 测 拮 抗 菌 菌 液 一 环 ， 接 种 于 pH5.7营 养肉 汤 培 养 基 （ 5ml） 中 ， 须 接 种 一 份 普 通 肉 汤 液 （ pH7.2） 作 对 照 。 37 培 养 ，1-3天 内 观 察 生 长 情 况 。 该 培 养 液 要 求 十
37、 分 澄 清 ， pH值 必 须 精 确 ， 须 用 酸 度计 调 测 。纤 维 素 分 解 试 验 ： 将 待 测 拮 抗 菌 接 种 于 放 有 滤 纸 条 的 基 础 培 养 基 （ 5ml）中 ， 需 做 不 接 种 的 空 白 对 照 组 。 37 培 养 1-4周 ， 能 将 滤 纸 条 分 解 成 一 团 纤 维或 将 滤 纸 条 折 断 或 变 薄 者 为 阳 性 ， 无 变 化 者 为 阴 性 。 同 时 ， 做 不 接 种 的 对 照试 验 。H2S产 生 试 验 ： 取 待 测 拮 抗 菌 种 一 环 ， 用 穿 刺 接 种 法 接 种 于 H2S培 养 基 中 ，37
38、培 养 5天 。 如 穿 刺 线 上 或 试 管 底 部 变 黑 者 为 阳 性 反 应 。吲 哚 产 生 试 验 ： 将 待 测 拮 抗 菌 一 环 接 种 于 吲 哚 培 养 基 中 ， 37 培 养 2、 4或 7天 后 ， 取 吲 哚 试 剂 数 滴 ， 沿 试 管 壁 缓 缓 加 入 （ 均 匀 摇 动 试 管 ） ， 在 液 层 界面 形 成 红 色 者 即 为 阳 性 反 应 。 如 仍 为 换 色 ， 则 为 阴 性 反 应 。以 上 实 验 均 有 3次 平 行 试 验 。2.3.4 拮抗细菌的 16S rDNA 序列分析细 菌 总 DNA提 取 、 16S rDNA片 段
39、回 收 、 E.coli质 粒 的 提 取 均 用 相 应 的 试 剂盒 操 作 （ 天 根 ） 。 引 物 由 上 海 生 物 有 限 公 司 合 成 。 上 下 游 引 物 序 列 分 别 为27F： 5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 和 1492R： 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3。 PCR扩 增 反 应 体 系 （ 30l） ： 1l模 板 ， 1l引物 ， 15lPfu PCR MasterMix， 13l双 蒸 水 。 PCR条 件 是 ： 95 ， 3min， 95 ，- 11 -50s， 52 ， 50s， 72
40、， 2min， 30个 循 环 ， 72 延 伸 10min。 PCR产 品 用DNA凝 胶 纯 化 试 剂 盒 纯 化 ， 经 1.5%的 凝 胶 电 泳 检 测 后 ， 与 pGM-T载 体 连 接 并转 化 到 E.coli DH5中 。 用 质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒 ， 送 上 海 生 工 测 序 。 使 用MAGE 3.1软 件 ， 采 用 NJ的 统 计 方 法 构 建 系 统 进 化 树 。三)实验结果3.1 拮抗菌初筛结果经 过 平 板 分 离 后 共 得 到 28株 ， 其 中 细 菌 18株 ， 放 线 菌 5株 和 丝 状 真 菌 5株用 于 拮 抗 菌
41、 的 初 筛 试 验 ， 见 表 3。表 3 拮 抗 菌 初 筛 结 果符号 1 2 3MHT1 + + +MHT2 + + +MHT3 + + +MHT4 + + +MHT5 + + +PG1 + + +PG2 + + +PG3 + + +PG4 + + +PG5 + + +PG6 + + +FP1 + + +FP2 + + +FP3 + + +FP4 + + +FP5 + + +FP6 + + +FP7 + + +FP8 + + +- 12 -SL1 + + +SL2 + + +SL3 + + +SL4 + + +QM1 + + +QM2 + + +FP2 + + +QM4 + + +QM
42、5 + - +QM6 + - -QF1 + + +QF2 + + +QF3 + + -SF1 + + +SF2 + + +3.2 拮抗菌复筛结果由 初 筛 结 果 可 以 发 现 ， 分 离 得 到 的 拮 抗 菌 对 病 原 真 菌 的 拮 抗 能 力 是 不 同的 。 菌 株 来 源 不 同 ， 拮 抗 能 力 不 同 ； 相 同 来 源 ， 对 不 同 病 原 真 菌 的 拮 抗 能 力也 不 同 。 这是由于不同拮抗菌和病原真菌的生物学特性不同造成的。本 研 究 从 实 际 应 用 出 发 ， 以 拮 抗 菌 生 长 能 力 旺 盛 、 对 甜 瓜 白 粉 病 病 原 菌 、甜 瓜 蔓
43、 枯 病 病 原 菌 、 甜 瓜 疫 病 病 原 菌 拮 抗 能 力 强 、 拮 抗 菌 来 源 多 样 性 为 复 筛标 准 ， 进 行 复 筛 。 复 筛 得 到 的 6 株 拮 抗 菌 进 行 后 续 研 究 ， 见 表 4。表 4 拮抗菌复筛结果符号 1 2 3MHT3 + + +PG4 + + +FP2 + + +FP3 + + +- 13 -SL2 + + +QF2 + + +3.3 拮抗菌鉴定3.3.1 形态鉴定结果对 6株 广 谱 性 拮 抗 菌 株 进 行 了 个 体 形 态 和 群 体 形 态 的 观 察 ， 结 果 见 表 5。 6株 拮 抗 细 菌 的 幼 龄 培 养
44、物 均 形 态 均 为 杆 状 ， 呈 革 兰 氏 阳 性 、 产 芽 孢 、 芽 孢 形状 呈 椭 圆 形 ， 孢 囊 膨 大 ， 同 时 从 菌 落 特 征 显 示 的 不 规 则 、 干 燥 、 不 透 明 ， 也说 明 他 们 均 有 芽 孢 产 生 ， 而 且 都 具 有 运 动 性 ， 从 这 些 形 态 特 征 可 以 得 出 ， 这 6株 细 菌 均 可 能 属 于 芽 孢 杆 菌 属 。- 14 -表 5 拮 抗 细 菌 的 形 态 特 征 结 果个 体 形 态 Individual 群 体 形 态 Colony菌 体 （ 微 米 ） Cell 芽 孢 Spore 菌 落 特
45、 征 Colony菌 株Strain呈 杆 状 aBacilus长Length宽Width2.5 mb革 兰 氏Gram形 状Shape位 置Location孢 囊 膨 大Be extruded形 状Shape质 地Character边 缘Margin光 学 特 性OpticsMHT3 + 1.3 0.8 - + 椭 圆 中 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 裂 叶 状 不 透 明PG4 + 1.1 0.7 - + 椭 圆 中 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 裂 叶 状 不 透 明FP2 + 2.0 0.9 - + 椭 圆 中 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 缺 刻 状 不 透 明F
46、P3 + 1.6 1.0 - + 椭 圆 中 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 裂 叶 状 不 透 明SL2 + 1.5 0.9 - + 椭 圆 生 到 次 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 波 状 不 透 明QF2 + 1.9 0.8 - + 椭 圆 端 生 到 次 端 生 + 不 规 则 干 燥 皱 褶 波 状 不 透 明- 15 -3.3.2 生理生化指标的鉴定结果6株 细 菌 的 生 理 生 化 指 标 测 定 结 果 见 表 6。 可 以 看 出 ， 6株 拮 抗 细 菌 均 具 好氧 性 ， 均 具 硝 酸 盐 还 原 酶 、 H2O2酶 、 淀 粉 水 解 酶 、 过 氧 化
47、 氢 酶 、 好 氧 性 试 验 、糖 发 酵 试 验 、 V.P试 验 等 。 依 据 微 生 物 分 类 学 （ 张 纪 忠 ， 1990） ， 可 确 定上 述 6株 产 芽 孢 细 菌 可 能 属 于 芽 孢 杆 菌 属 。16表 6 芽 孢 杆 菌 的 生 理 生 化 特 征 V P 温 度 糖 发 酵 耐 盐 性葡 萄 糖 其 他 糖 NaCl（ %）Strains 过氧化氢酶严格好氧硝酸盐还原淀粉水吲哚产生H2S产生酪素水解柠檬酸盐利用兼性好氧或微好氧pH5.7营 养肉 汤试验试验pH4565发酵产气乳糖甘露醇2 5 7 10MHT3 + + + + - - + + - + +
48、5.77 + - + - - + + + + +PG4 + + + + - - + + - + + 5.8 + - + - - + + + + +FP2 + + + + - - + + - + + 7.00 + - + - - + + + + +FP3 + + + + - - + + - + + 8.17 + - + - - + + + + +SL2 + + + + - - + + - + + 7.00 + - + - - + + + + +QF2 + + + + - - + + - + + 7.03 + - + - - + + + + +三主要参考文献1 Abd-El Moity T.H.,
49、Papavizas G.C.,Shatla N.N.,Induction of new isolates of Trichoderma harzianum tolerant to fungicides and their experimental use for control of white rot on nionJ.Phytopathology.1982,72:396-4002 Acea M. J, Moore C. R, Alexander M, Survival and growth of bacteria introduced into soil J. Soil Biol. Biochem.1988, 20: 509-515.3 Agrawal GK, Jwa NS, Rakwal R. A, novel rice (Oryza sativa L
