1、CHIP PROTOCOL（基于 millipore EZ-CHIP catalog#17-371）：实验原理：在活细胞状态下固定蛋白质DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。 实验步骤：第一天：【实验材料准备】：1000ul、100ul、200ul、20ul 移液器，大、中、小号 tip，1.5ml EP 管，200ul PCR管。【实验仪器准备】：台式低温离心机，超声仪，电泳设备一套，旋转混匀仪，层析柜。【实验试剂准备】：SD
2、S lysis buffer 复温，使其充分溶解，避免沉淀；protease inhibitor cocktail 室温下充分解冻；PBS 预冷（若使用试剂盒提供 10xPBS，使用前还需用去离子水稀释成1xPBS 工作液）。（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎*。1、收集细胞（1-2x107），加入 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%（0.7% ）。2、室温孵育 10min（精确计时）。3、及时终止交联：加 10x 甘氨酸终浓度为 1x。混匀后，在室温下放置 5min。4、沉淀细胞（700g 4 2-5min），用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。5、弃上清（细胞沉淀可以暂时冻存于-80 备用
3、）。6. 准备裂解液（1ml SDS lysis buffer+5ul protease inhibitor cocktail）；按照细胞量（1x107 hela 细胞对应 1ml SDS lysis buffer）加入 SDS Lysis Buffer，重悬细胞。分装成 300-400ul1 管（裂解产物可以 -80冻存备用）。7、超声破碎（根据具体情况调整）：普通超声仪： 3 档 冲击 15s 冰上放置 45s 共 5 次Bioruptor 超声神器： 中档 冲击 15s 停顿 45s 14 次（更均一更集中）8、琼脂糖凝胶电泳鉴定：取 1x105 个细胞，加入 CHIP dilution
4、 buffer 至终体积50ul，进行解交联后电泳Option1a. 加入 RNase A（10mg/ml）1ul ，37孵育 30 分钟。b. 加入蛋白酶 K 1ul，62 孵育 2 小时。c. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压 130V 时间 20min），smear 条带集中在 200-1000bp 即可，500 左右为佳。Option2a. 加入蛋白酶 K 1ul，62孵育 2 小时。b. 每 50ul 样本加入 0.25ml 结合试剂 A（5 倍体积），充分混匀。c. 将上述混合液转移至吸附柱中，吸附柱放在收集管内。d. 1000015000g 离心 30 秒，去下清。e向吸附柱内加
5、入洗涤液 B 500ul，1000015000g 离心 30s，去下清。f. 空离 30s，1000015000g。g. 将吸附柱转移至新的 EP 管，向吸附柱中心滴加 50ul 洗脱液C，1000015000g 离心 30s，洗脱液即为纯化回收的 DNA。h. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压 130V 时间 20min），smear 条带集中在 200-1000bp 即可，500 左右为佳。9、离心去除不溶物质（1000015000g 4 10min），收集上清，分装至 100ul 1 管，-80 可保存 2 个月。【实验补充及注意事项】：1、不是所有 CHIP 都需甲醛固定。做甲醛固定的
6、为 X-ChIP，而不需要固定的为 N-ChIP。 native ChIP 主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究,由于组蛋白与 DNA 之间的作用力较强，因此 N-CHIP 不需要采用甲醛固定，而是让 DNA 结合蛋白与 DNA 之间保持一种自然状态，采用微球菌核酸酶对染色质进行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应, 因为它们本身来说和 DNA 结合的非常紧密. 组蛋白 H2A 和 H2B 并不是紧密联接,但是在 native ChIP 中依然可以不需要交联反应 .X-CHIP 适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究。2、当用甲醛处理时，相
7、互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或 RNA）之间会产生共价键。例如细胞内，当 TF 与 Promoter 相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。甲醛的交联反应是完全可逆的，交联的进程可被加入的甘氨酸终止。3、交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响 ChIP 结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失，另外基因组上结合了太多的蛋白，也会增加背景；交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。4、超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响 C
8、hIP 的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。使用普通超声仪时超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。5、有研究建议解交联后琼脂糖凝胶电泳鉴定，具体步骤如下：取 5ul 超声破碎后产物，加入 5M NaCl（终浓度为 0.2M NaCl），65处理 2h 解交联，电泳检测超声效果。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp1000bp（以 3 个核小体左右大小为宜，大约 500bp 左右）。普通超声仪效果：Bioruptor 超声效果：（二）、预清洁及抗体孵育。10、准备足够 Dilut
9、ion buffer（900ul dilution buffer+4.5ul protease inhibitor cocktail）。11、每 100ul 的超声破碎产物中（冰上解冻），加入 900ulChIPDilutionBuffer。再各加入 60ulProteinGAgarose/SalmonSpermDNA（预清洁），4旋转混匀 1h*。12、1h 后，在 4静置 2min 沉淀，4 3000-5000g 离心 1min。13、取上清，每个样本留取 10ul 做为 input，4保存备用*。14、收集剩余约 1ml 上清至新 EP 管，加入 IP 抗体（具体加入抗体量具体调整）*。
10、阳性对照：加入 1ug anti-RNA polymerase 抗体阴性对照：加入 1 ug 目的抗体来源种属的 IgG 实验组：加入目的抗体（1-10ug，可根据抗体说明书决定用量，一般 3ug 左右）15、4 旋转混匀过夜（12-16h ）。【实验补充及注意事项】1、吸取琼脂糖珠子的中号 tip 需减头，避免机械力破坏珠子，且珠子需充分混匀。2、鲑鱼精子 DNA 包被琼脂糖珠子，因为鲑鱼精子用于降低降低染色质 DNA 与琼脂糖珠子的非特异性结合。Proterin A/G 可以与抗体 Fc 段结合。蛋白质 A 结合到 IgG 的 Fc部分。蛋白质 G 选择性结合到 IgG 的 Fc 部分，但
11、也能结合到 Fab 区域，因此可用于纯化IgG1 的 Fab 片段。 3、input 是用来检查 PCR 系统是否 work。4、抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在 ChIP 实验中容易被 DNA 包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做 ChIP 的抗体一般是需要经过 chip 实验验证的，必须是 IP 级别的抗体。5、单抗与多抗的选择：单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是
12、多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。第二天：【实验材料准备】：1000ul、200ul、20ul 移液器，大、中、小号 tip，1.5ml EP 管。【实验仪器准备】：台式低温离心机，旋转混匀仪，层析柜，水浴锅（调节水浴锅温度到 65备用）。【实验试剂准备】：室温充分溶解 1M NaHCO3。（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。16、孵育过夜后，每管中加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4旋转孵育 1h。17、4 静置 10min 后，4 30005000g 离心 1m
13、in。除去上清。18、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入 1ml 洗涤液，在 4旋转孵育 3-5min，4 静置 2min 沉淀，3000-5000g 离心 1min，除去上清。洗涤溶液*：a.low salt wash buffer-1 次b.highsalt wash buffer-1 次c.LiCl wash buffer-1 次d.TE buffer-2 次19、洗脱：洗脱液的配方：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3，170ulddH2O，共200ul。Input 管加入 200ul 洗脱 buffer，室温下备用；IP 管加入 100ul 洗脱液，轻柔弹匀，室
14、温孵育 15min，离心（ 4 3000-5000g 1min）后，收集上清至新 EP 管。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 200ul。20、解交联*：每管中加入 8ul 5M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2M）。混匀，65解交联，时间 4-5h 或者过夜。（解交联后样本可冻存在-20备用）【实验补充及注意事项】：1、头四次洗涤不要求完全弃上清，避免反复及不必要的样本丢失，最后一次要求尽量去除干净上清。2、虽然说明书上说 4 小时已经足够，但是建议解交联过夜。因为在那样环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。注意在 EP 管口封上封口膜（避免样本蒸干）。 第三天：【实验材料准备】
15、：1000ul、100ul、200ul、20ul 移液器，大、中、小号 tip，1.5ml EP 管。【实验仪器准备】：台式低温离心机，水浴锅（调节水浴锅温度到 37备用）。【实验试剂准备】：充分解冻 RNaseA、蛋白酶 K，准备足量 0.5MEDTA 及 1MTris.HC，CHIP 配套DNA 回收试剂、收集管、吸附柱，或者 Promega 回收试剂盒 A9281，95%乙醇，漂浮板。（一）、DNA 样品的纯化回收21、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA，37孵育 30min。22、每管加入 4ul 0.5MEDTA，8ul1MTris.HCl，1ul 蛋白酶 K（可预先配成
16、mix）。水浴锅 45处理 1-2h。23、DNA 片段的回收Millipore：a. 每管加入 1ml 结合试剂 A（5:1 体积），混匀，终体积 1200ul。b. 将样本与结合试剂混合液分两次转移至吸附柱（吸附柱放置在收集管内），每次 600ul，离心（10000-15000g 30s）弃下清。c. 500ul 洗涤试剂 B 洗涤吸附柱，离心（10000-15000g 30s）弃下清。d. 空离（10000-15000g 30s）后，将吸附柱转移至新收集管。e. 向吸附柱中央吸附膜上滴加 50ul 洗脱试剂 C，离心（10000-15000 30s），弃吸附柱，收集管内洗脱液即为纯化回收
17、的 DNA 样本，可以冻存在-20供后续分析。promega 胶回收试剂盒：a. 第一次打开试剂盒时，MWS 中加入 95%乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。b. 加等倍体积的 MBD 至胶中（胶体350mg ，点离；c. 55-65C 水浴 10 分钟，水浴过程中每隔 2-3 分钟振荡 EP 管一次，以帮助凝胶溶解；d. 将 SV 微型柱置于 2ml 的收集管中，待上一步的所有液体冷却至室温后，将其加入离心柱中，室温孵育 1min，13,000rpm 离心 1 分钟；e. 弃掉废液，将离心柱放回收集管中；f. 向离心柱中加入 700ul 的 MWS，13,000rpm 离心 1 分钟，倒掉废液
18、，将离心柱放回收集管中；g. 向离心柱中加入 500ul 的 MWS，13,000rpm 离心 5 分钟； h. 倒掉废液，将离心柱放回收集管中， 13,000rpm 再离心 2 分钟；i. 将离心柱放入干净的 1.5mlEP 管中，室温干燥 2 分钟，再向离心柱的膜中央悬空滴加 50ul 的无酶水，室温孵育 1 分钟后，13,000rpm 离心 1 分钟，所得液体即为纯化的PCR 产物。j. 将上述所得液体重新悬空滴加至离心柱膜中央，室温孵育 1 分钟后 13,000rpm 离心 1 分钟。k. 纯化后的 PCR 产物于-20C 保存。【实验补充及注意事项】;1、样品中 SDS 样品较高，普
19、通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀（网络意见尚未验证）。实验结果分析【CHIP-qPCR】：假设对照组 S1，实验组 S2 计算如下：Input Dilution Factor=100（fraction of the input chromatin saved) -1 (-1 次方)）% InputNormalized (S1)：1） Ct normalized ChIP (S1)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilu
20、tion Factor)Ct normalized ChIP (IgG/NIS)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)2）% InputAntibody = Log2 (-Ct normalized ChIP)% InputIgG/NIS = Log2 (-Ct normalized ChIP)3）%InputNormalized (S1)= % InputAntibody - % InputIgG/NIS% InputNormalized (S2)计算：1)Ct normalized ChIP (S2)= (Ct ChIP -
21、 (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)Ct normalized ChIP (IgG/NIS)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)2）% InputAntibody = Log2 (-Ct normalized ChIP)% InputIgG/NIS = Log2 (-Ct normalized ChIP)3）%InputNormalized (S2)= % InputAntibody - % InputIgG/NISFold Change = % InputNormalized (S2) / % InputNormalized (S1)
