1、甲基化检测（detection of methylation）概念：DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在 DNA 甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使 CpG 二核苷酸 5-端的胞嘧啶转变为 5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种 DNA 修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物 DNA 的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因 CpG 岛以外的 CpG 序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的 CpG 则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。现有检测方
2、法1.甲基化特异性的 PCR(Methylation-specific PCR，MSP)用亚硫酸氢盐处理基因组 DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行 PCR。通过电泳检测 MSP 扩增产物，如果用针对处理后甲基化 DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)用亚硫酸氢盐处理基因组 DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计 BSP 引物进行 PCR，在扩增过
3、程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对 PCR 产物进行测序就可以判断 CpG 位点是否发生甲基化称为 BSP-直接测序方法。将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为 BSP-克隆测序法。3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)在非 CpG 岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的 DNA 双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的 CpG 岛。若这些 CpG 岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经 PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的 GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。送样要求细胞(10 6 个) 、组织(300mg) 、血液( 1ml)、血清( 1.5ml) 等样品材料，基因组 DNA(体积20l，浓度50 ng/l)。
