1、CHIP实验流程图（CST9002） 第一天 A体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质 预热的试剂：200X蛋白酶混合抑制剂 1 M的二硫苏糖醇 0.1 M PMSF 10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：50ml离心管 4个 1.5ml EP 7个 水浴锅 37C 15ml离心管 4个 台式冷冻离心机 4C 配液并预冷：10X 甘氨酸溶液 10 ml 1X PBS 200 ml 1mMPMSF：1X PBS 30 ml PMSF 300 l 1X缓冲液 A（10ml）： 4X缓冲液A 2.5 ml 水 7.5 ml 1 M DTT 5 l 200X PIC 50l 0.
2、1MPMSF 100 l 1X 缓冲液 B（11ml）： 4X 缓冲液B 2.75 ml 水 8.25 ml 1 M DTT 5.5 l 1X ChIP缓冲液（1.25ml）： 10X ChIP缓冲液 125 l 水 1125 l 200X PIC 6.25l PMSF 12.5 l 3min颠倒混匀1次 2个10cm培养皿（90%）+10ml培养基 额外一盘细胞用于测定细胞数 270 l 37%的甲醛/10ml培养基、转动混匀，室温放置10min 甲醛的终浓度为 1% 培养基会变色 1 ml 10X 甘氨酸、转动使之混匀，室温孵育5min 培养基会变色 弃培养基、冷PBS漂洗两次（10 ml
3、 /次） 彻底弃净PBS 2 ml冷1X PBS + PMSF、刮下细胞并合并收集 2ml、1 ml冷1X PBS + PMSF依次冲洗合并收集 4C 1500rpm离心5分钟，弃上清 加入3.385 ml冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF重悬细胞。冰上孵育10min 4C 3000rpm离心5分钟，弃上清 加入3 ml冷缓冲液 B + DTT重悬细胞核 加入400l冷缓冲液 B + DTT重悬细胞核，将样品转移到1.5 ml离心管 加入2 l微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37C孵育20 min 5min颠倒混匀1次，150-900 bp 加40 l 0.5 M EDTA终止消化
4、,置冰上;4C 13000rpm离心1min，弃上清 加入4001X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF重悬细胞核，冰上孵育10min 4C 3000rpm离心5分钟，弃上清 超声20s，冰上孵育30s破碎核膜，共3次；4C 10000rpm离心10min 上清（交联的染色质）移到新管子中， -80C保存，取50 l分析DNA的酶切情况及其浓度 B. 分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤） 准备：在DNA漂洗液中加入24 ml无水乙醇 1.5ml EP 3个 水浴锅 65C DNA离心柱： 3个 DNA收集管： 3个 50 l的染色质样品 来源于A中最后一步 加100 l无核酸酶的水，
5、6 l 5 M NaCl 和 2 l RNAse A 涡旋震荡，3730min 加入2 l 蛋白酶K 涡旋震荡，652h 加入750 l DNA结合缓冲液 涡旋混匀器稍加震荡 DNA离心柱插入到收集管中并做标记 吸取450 l样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 吸取450 l样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 在离心柱中加入750 l的DNA漂洗缓冲液 14000rpm离心30sec 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插
6、回到收集管中 14000rpm离心30sec 取出离心柱，插入到干净的1.5 ml离心管中，将收集管和废液一起丢弃 在离心柱中加入50 l DNA 洗脱缓冲液 14000rpm离心30sec 丢弃DNA离心柱 DNA测含量、-20C保存、取10 l经1%琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段大小为150-900 bp C. 染色质免疫沉淀 第二天 预热的试剂：200X蛋白酶混合抑制剂 交联的染色质样品（来自A部分最后一步） 10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：1.5ml EP 11个 15ml离心管 5个 台式冷冻离心机 4C 预冷：ChIP级的G蛋白琼脂糖微球 #9007 免疫沉淀所
7、用的抗体：USP22 ubH2B H2B 组蛋白H3 正常兔IgG 注意：交联的染色质样品也可以进行稀释，将抗体直接添加到未稀释的染色质样品中沉淀染色质复合物 配制1 X ChIP缓冲液（4.2ml） 10 X ChIP 缓冲液： 420 l 水： 3.78 ml 蛋白酶混合抑制剂： 21 l 分装到4个15ml管 1.2ml、1.2ml、1.2ml和0.6ml 分别加入0.3ml、0.3ml、0.3ml、0.15ml+0.05ml消化后的染色质样品 10-20g染色质DNA 取10 l转移到微量离心管中（3个）即2%样品输入对照，-20C保存 500 l稀释的染色体样品到各个离心管 加入对应
8、的抗体 加入30 l的ChIP级的蛋白G 4C的转子上孵育2h USP22 2.2l 3管 ubH2B 2l 3管 H2B 2l 3管 组蛋白H3 10l 1管 正常兔IgG 5l 1管 4C的转子上孵育过夜 开始D部分操作 D. 漂洗免疫沉淀的染色质： E. 将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱并解交联 预热的试剂：10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：50ml离心管 1个 15ml离心管 1个 台式冷冻离心机 4C 配液并预冷： 低盐漂洗液: 10 X ChIP缓冲液 3.3ml 水 29.7 ml 高盐漂洗液: 10 X ChIP 缓冲液 1.1ml 水 9.9ml 5M N
9、aCl 770 l 预热的试剂：2X ChIP洗脱缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：15ml离心管 1个 1.5EP管 11个 台式冷冻离心机 4C 水浴锅 65C 配液：1 X ChIP洗脱缓冲液: 2 X ChIP洗脱缓冲液 1.125ml 水 1.125ml 将样品4C 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml低盐漂洗液重悬微球 4C转子上孵育5min 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 将样品4C 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml低盐漂洗液重悬微球 4C转子上孵育5min 将样品4C 6
10、000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球，弃上清 加入1 ml高盐漂洗液重悬微球 4C转子上孵育5min 2%样品输入对照 加入150 l 1 X ChIP洗脱缓冲液 室温放置 加入150 l 1 X ChIP洗脱缓冲液 1200 rpm涡旋震荡65C孵育30min，室温也可 6000rpm，离心1min，沉淀蛋白G琼脂糖微球 将上清移至新管 加入6 l 5 M NaCl和2 l 蛋白酶K，65C孵育2h F. 用离心柱纯化DNA。 准备：1.5ml EP 14个 水浴锅 65C DNA离心柱： 14个 DNA收集管： 14个 150 l的染色质样品 来源于E中最后一步 加入750 l
11、 DNA结合缓冲液 涡旋混匀器稍加震荡 DNA离心柱插入到收集管中并做标记 吸取450 l样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 吸取450 l样品分别上样到各自的离心柱中 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 在离心柱中加入750 l的DNA漂洗缓冲液 14000rpm离心30s 把离心柱从收集管中取出，倒掉废液。将离心柱插回到收集管中 取出离心柱，插入到干净的1.5 ml离心管中，将收集管和废液一起丢弃 在离心柱中加入50 l DNA 洗脱缓冲液 14000rpm离心
12、30s 丢弃DNA离心柱 DNA测含量、-20C保存，用于PCR或定量PCR定量DNA含量 14000rpm离心30s G. 实时定量PCR方法： 建议： 实验中使用带滤芯的枪头以尽可能减少污染的可能性。 试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因，既可以用于常规PCR 也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP 样品来源于其它他物种，建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。 建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。 PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计： 引物长度: 24个核苷酸 最佳Tm值： 60C 最佳GC含量: 50
13、% 扩增片段长度： 150-200 bp（用于常规PCR） 80-160 bp （用于实时定量PCR） 实时定量PCR方法： 1. 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照做一系列稀释（不稀释，1：5，1：25，1：125），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。 2. 在每个反应管或孔（板上）中加入2 l相应DNA模板。 3. 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 l反应液混合物。 试剂 每个PCR反应（20 l）所需体积 无核酸酶的水 6 l 5 M RPL30 引物 2 l SYBR-Green反应体系 10 l 4. 按下面程序执行PCR： a. 预变性 95C 3 分钟 b. 变性 95C 10 秒 c. 退火及延伸： 60C 30 秒 d. 重复第2及第3步，共40个循环 5. 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。
