1、核酸的分离与纯化,基本知识回顾,核酸(nucleic acid)：以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子具有复杂的结构DNA 重要的功能 天然存在的核酸 信息的载体RNA 信息的储存、传递与表达,DNP-脱氧核糖核蛋白 RNP-核糖核蛋白 真核生物-染色体DNA和细胞器DNA 原核生物-双链环装质粒DNA,基本知识回顾,基本知识回顾,DNA模式图,第一节 核酸分离与纯化的设计与原则,DNA 组成：染色体DNA、细胞器DNA、质粒DNA。 分子总长随生物进化程度而增长,RNA 分子比DNA分子要小的多。 功能多样性 种类、大小、结构都具多样性,简述DNA与RNA的区别,DNA与RNA性质上的差
2、异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。,一、材料与方法的选择,材料与方法的选择临床标本繁多：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等不同的研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度可能有不同的要求，还需考虑制备核酸所需的时间与成本，在不影响核酸质量的情况下，应选择完全无毒的试剂与方案。 选择原则一是保证核酸一级结构的完整性二是尽量排队其它分子的污染，保证样品的纯度。 保持核酸的完整性首先，应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（pH，高温）其次，对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏（提取时间、DNA酶、RNA酶等）。,核酸的释放DNA与RNA均位于细胞内，因此核酸分
3、离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。机械法 液体剪切法 细胞的破碎方法 固体剪切法非机械法 干燥法溶胞法,二、技术路线的设计,机械法主要危害高分子的线性DNA，此法不适全于染色体DNA的分离与纯化。,（采用适宜的化学与酶能有效的裂解细胞，方法温和，能保证较高的得率和保持核酸的完整性）,核酸的分离与纯化：利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。 细胞定位与组织分布上的差异核酸与其它物质的差异： 物理化学性质上的不同各自独特的生物学特性,二、技术路线的设计 续,核酸分离与纯化简易图,核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不
4、可避免的丢 失，样品中核酸的浓度会下降,二、技术路线的设计 续,对核酸进行浓缩,沉淀是核酸浓缩最常用的方法 （加入一定浓度的盐类后屏蔽磷酸基团，用有机溶剂如乙醇、异丙醇沉淀核酸）,核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除,核酸的鉴定 1.浓度鉴定：可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。紫外分光光度法： 原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为260nm，溶液中核酸的浓度与溶液在260nm紫外线下的吸光度（修正参数：A260A310）成正比。 灵敏度：0.25ug/ml荧光光度法： 原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无
5、荧光的核酸在紫外线激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。 灵敏度：1-5ng,三、鉴定与保存,2.纯度鉴定： 紫外分光光度法 DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降RNA（260nm）使比值升高RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级 结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。,三、鉴定与保存,2.纯度鉴定： 荧光光度法 用EB示踪，进行核酸电泳： DNA分子电泳迁移率低； 总RNA（三条带）：23S
6、 rRNA 28S rRNA 16S rRNA 18S rRNA5S rRNA + tRNA 5S rRNA + 5.8S rRNA + tRNA,三、鉴定与保存,原核生物,真核生物,3.完整性鉴定(1) 凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。 DNA：若有降解的小分子DNA，电泳有脱尾 RNA：三个条带荧光强度积分应呈特定的比值。(2) 其它方法：,三、鉴定与保存,核酸的保存DNA保存：DNA溶于TE缓冲液（pH8.0）中在-70度可以储存数年；EDTA螯合二价金属离子，可以抑制DNA酶的活性；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染小量分
7、装保存,三、鉴定与保存,核酸的保存RNA保存 1.可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水中,在-70度至-80度保存 2.若以焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA或在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白或氧钒核糖核苷复合物（VRC)，可延长保存时间 3.RNA沉淀溶于70乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液，可在-20度长期保存 4.小量分装保存,三、鉴定与保存,双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子。但由于是很长的线性分子，而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。 尽管基因组DNA因来源、性质以及用途不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要试剂及其作用原理是一样
8、的。,第二节 基因组DNA的分离与纯化,酚抽提法：本法以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。 EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。 SDS为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。 无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶和细胞中的蛋白质 酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DN
9、A酶的活性。 pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。 多次抽提可提高DNA纯度。一般在抽提二至三次后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。 酚抽提法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10ug，至多到数百微克的DNA样品。,一、分离与纯化的方法,甲酰胺解聚法细胞裂解与蛋白质水解步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性，但对蛋白酶K的活性无显著影响。由于本
10、方法操作步骤少，尤其减少了酚的多次提取，所以获得的DNA分子量一般可以大于200kb。由于需要充分的透析，用该法制备DNA所需时间长而且所得DNA浓度低（约10ug/ml）玻棒缠绕法该法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。玻棒缠绕法有两个关键步骤：一个基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面，二是把沉淀的DNA缠绕于带铯玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从无水乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。制备的DNA分子 量大约只有80kb。,一、分离与纯化的方法 续,其它方法 异丙醇沉淀法玻璃珠吸附法将完整细胞悬浮在融化的低熔点琼脂糖中进行细胞的原位裂解与蛋白水解，然后通过漂洗
11、去除细胞碎片，可以避免DNA分子在分离提取的操作中受到剪切而获得完整的DNA分子。,一、分离与纯化的方法 续,DNA样品的进一步纯化某些限制性内切酶的消化、基因克隆、转染以及基因组文库的构建等对DNA的纯度与完整性要求较高，此时需对DNA样品作进一步的纯化处理。包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率非常高，电泳容量比琼脂糖凝胶大，而且从聚丙烯酰胺凝胶中回收的核酸纯度很高。由于孔径较小，PAGE最有效的分离范围为5-500bp，故PAGE仅适合于小片段DNA的分离与纯化。琼脂糖凝胶分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，可以分离大小从50bp到几个Mb的DNA，其中脉冲场凝胶电泳(PF
12、GE）可以分离几个Mb的DNA。,一、分离与纯化的方法 续,原则与要求1. 提高DNA片段的回收率为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而达到。在能达到一定回收率的条件下，一般选择减少回收体积的做法。2. 去除回收DNA样品中的污染常用方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。柱层析法采用阴离子交换层析的原理。有机溶剂抽提法和柱层析法以及其它方法最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。,二、DNA片段的回收,从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1.DEAE纤维素膜插片电泳法：阴离子交换；500bp5kb2.电泳洗脱法：切胶纯化
13、3.冷冻挤压法：液氮冷冻挤压；5kb4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：切胶纯化；PFGE高分子量DNA 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段压碎与浸泡法：能较好回收1kb的DNA，回收率依分子量不同为30-90，DNA纯度高，无酶抑制剂，是小片断DNA回收的较好方法。,二、DNA片段的回收,可行性：是否简便、快速、安全及成本如何可靠性：稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量、最小样品用量等,三、基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证,质粒是原核生物中染色质以外的遗传物质，携带的基因包括耐药性基因、毒力基因等，大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒(CCC plasmid)DNA，简称闭环质粒，为
14、携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体(Vector),第三节 质粒DNA的提取与纯化,包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法等。 由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。 按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量(1-2ml)制备、质粒DNA的中量(20-50ml)制备及质粒DNA大量(500ml)制备,一、提取与纯化方法,碱裂解法碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。在NaOH存在的强碱性(pH 12.0-12.6)条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白
15、质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞被裂解后，细胞壁碎片与变性的 蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。通过无水乙醇沉淀上清中的质粒DNA，并有70%的乙醇洗涤，如此制备的核酸其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。,一、提取与纯化方法 续,碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌(E.coli）菌株中分 离出质粒DNA，制备量可大可小。,煮沸裂解法将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体 DNA变
16、性。CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。煮沸裂解法是一种条件比较剧裂的方法，只能用于小质粒DNA(15Kb)的小量与大量制备，适用于大多数E. coli菌株。由于糖类很难去除，而且糖会抑制限制性酶和聚合酶的活性，所以本方法不适用于在去污剂、溶菌酶和加热情况下可释放大量糖类的E. coli菌株。另外，煮沸不能完全灭活核酸内切酶A(endonuclease A，endA）的活性，因此本方法不适用于表达endA的菌株。,一、提取与纯化方法 续,SDS裂解法条件温和，有利于大质粒DNA的提取，但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠结在一起而丢失，故产率不高。其它方法小量一步提取法：简单快速、实验成本低，抽
17、提的质粒可用于内切酶图谱分析牙签少量制备法：制备的质粒DNA有较多污染，不能用于限制性酶切反应，但可用于重组质粒的鉴定。通过凝胶电泳，可以判断转化子中质粒的大小，并能比较各种质粒在同一宿主细胞中的拷贝数。,一、提取与纯化方法 续,质粒DNA的纯化通过各种裂解法制备的质粒DNA通常有较多RNA与不等量的染色体DNA污染。纯化的方法非常多，效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（简称CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。,一、提取与纯化方法 续,质粒DNA的纯化1. CsCl-EB法： CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连
18、续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。,一、提取与纯化方法 续,经典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、纯化效果好，至今仍是质粒DNA纯化的标准方法，但该法很费时并需要昂贵的设备与试剂，目前主要用于纯化容易出现切口的极大质粒DNA和具某些特殊用途的闭环质粒DNA,如哺乳动物细胞微注射和生物物理学测定。,质粒DNA的纯化2. 聚乙二醇沉淀法： 是一种分级沉淀法。先用LiCl沉淀大分子RNA，RNase消化小分子RNA用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀,一、提取与纯化方法 续,该法简单、经济、适用广泛，尤其
19、对碱裂解法提取质粒的纯化效果好，但不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。,质粒DNA的纯化3. 柱层析法： 柱层析法纯化质粒DNA的关键是用于填充层析柱的树脂。树脂可分为二类：一类是利用疏水的相互作用纯化质粒DNA样品另一类是通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化由于小于100-200bp的DNA分子与硅基质的吸附力很弱，因此硅胶吸附柱层析不能用于小分子DNA片断的纯化。柱层析法在质粒DNA的纯化中应用十分广泛，但其纯化效果并不优于其它方法，而且成本较高。,一、提取与纯化方法 续,为获得一定纯度的某一特定修饰的质粒DNA，常通过凝胶电泳分离并回收。,二、质粒DNA的回收,方法学评价
20、方法较多，但需注意在质粒DNA的裂解提取过程中，不可随意延长变性时间，否则质粒可能发生不可逆的变性。质量保证无论用何种方法制备的质粒DNA，其质量都应该满足下一步实验的要求。必须严格控制质粒提取纯化的全过程，并重视细菌的培养、收集与裂解等环节，回收的质粒DNA必须进行含量、大小、纯度及完整性的鉴定，必要时进行测序分析,三、质粒DNA提取纯化的方法学评价与质量保证,RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%-85%，tRNA及核内小分子RNA占15%-20%，mRNA仅占1%5%。目前对RNA的分离与纯化主要指总RNA与mRNA的分离与纯化。,第四节 RNA的分离与纯化,RNA容易被RNase（
21、分布广泛，对加热和各种变性剂稳定）水解，因此在RNA的制备过程中，排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关链因素。为防止RNase对RNA的水解，一要避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。应选择： 洁净的实验室操作者必须戴手套与口罩实验用的试剂与器材应严格选择与控制所有玻璃器皿与溶液均应以RNase的抑制剂DEPC进行 处理，并在处理后除去残留的DEPC在沐浴条件下,一、RNA制备的条件与环境,1. 由于受RNase的影响，为获得完整的RNA分子，必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内的RNase的活性（RNase
22、蛋白质变性剂、蛋白水解酶、阴离子去污剂、RNase特异性抑制剂等）。 2. 在RNA纯化时，应使用pH4.5-5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离 3. 在DNA与RNA的提取过程中，酚与氯仿经常结合、交替使用 4. 在抽提过程中加入少量异戊醇，目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。 5. 对含量较低的样品，加入糖原可以提高RNA的回收率。,二、总RNA的分离与纯化,(异)硫氰酸胍酚氯仿一步法(异)硫氰酸胍酚氯仿法是经典的一步法，用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。 (异)硫氰酸胍与-巯基乙醇变性溶液裂解细胞，酚/氯仿抽提裂解溶液，最后用异丙
23、醇沉淀和75乙醇洗涤而获得RNA。简便、经济和高效，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高。总RNA的产量取决于标本的起始量。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA，且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染，这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解和抑制RT-PCR反应。污染物还会结合到膜上而影响RNA杂交。,二、总RNA的分离与纯化 续,同时制备RNA、DNA与 蛋白质的一步法本方法是(异)硫氰酸胍酚氯仿一步法的改进方法。 以(异)硫氰酸胍-酚的单向裂解试剂裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙
24、醇沉淀与75%乙醇洗涤而获得。此法获得的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染，可用于mRN的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应。目前该法已成为最常用的总RNA提取法。其它方法,二、总RNA的分离与纯化 续,真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。 mRNA有何特别之处？除血红蛋白和某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3末端带有一个20-200个腺苷酸组成的多聚腺苷酸结构：poly(A)尾。 以总RNA制品为起始材料，利用核糖的碱基配对原理，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易同时分离不同种类与大小的mRNA分子群体。
25、,三、mRNA的分离与纯化,Oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。从哺乳动物细胞撮大量的mRNA时，oligo(dT)-纤维素柱层析是首选方法。用oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂合体，洗去未结合的其他RNA，在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)RNA。本方法的缺点是分离速度较慢，层析柱易阻塞，不适合同时处理多个标本，而且很难回收到全部的poly(A)RNA，所以不适合对少量RNA样品的分离。,三、mRNA的分离与纯化 续,Olig
26、o(dT)-纤维素液相结合离心法为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的层析法 直接将oligo(dT)-纤维素加入一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)RNA的oligo(dT)-纤维素，漂洗后再用70乙醇洗脱液将吸附的poly(A)RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)RNA。用本方法分离poly(A)RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30-纤维素，而充填层析柱的纤维素大多用oligo(dT)12-18。,三、mRNA的分离与纯化 续,其它方法oligo(dT)-纤维素离心法磁珠分离法Poly(U)-凝胶层析法Poly(U)-滤纸法,三、mRNA的分离与纯化 续,谢 谢！,
