1、生物技术核心课程,Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理,生命学院遗传与基因工程教研室 王桂华,教学目的与要求,本课程充分考虑到我院学生的来源及其知识结构的特点，着重加强有关基因工程原理部分的讲授，并努力将基因工程学同分子生物学、分子遗传学以及生物化学等基础学科有机地联系起来进行讨论。在内容安排上，强调基础性、先进性、系统性和实用性，同时也努力反映国内外有关学者的最新研究成果。,教学目的与要求,本课程为分子生物学、分子遗传学、发育生物学、细胞生物学、生物化学等有关专业研究生的学科基础课，同时也是植物学、动物学以及微生物学等专业研究生的重点选修
2、课。我们期望不同专业的研究生在修完本课程之后，能够较为系统、全面地掌握基因工程的基础知识和最新进展，并能跟上该专业学科的发展进程。,教学目的与要求,上课方式：讲解为主，讨论为辅 考试时间：待定 考试方式：平时+卷面 勤于思考，勇于发言 Participate and Enjoy it!,参考书,吴乃虎，基因工程原理(第二版，上册)，科学出版社，1998 吴乃虎，基因工程原理(第二版，下册)，科学出版社，2001 楼士林等，基因工程(第一版)，科学出版社，2002 吴乃虎、张方、黄美娟，基因工程术语，科学出版社，2005 GENE VII或VIII 分子克隆实验指南(第三版),本课程的地位：,现
3、代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,基因工程纲要,第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的克隆与分离 第六讲 克隆基因的检测与功能鉴定 第七讲 克隆基因的表达与产物纯化 第八讲 基因表达的调控,第一讲 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然生命 2、基因研究的发展 3、基因的现代概念 4、基因工程的诞生与发展 5、基因工程的应用 6、基因工程的安全性,现代生物技术,从传统的生物技术 到现代生物技术,基 因 工 程,细 胞 工 程,现代生物技术的人文忧患,基因工程发展的过程,基因工程的本质特征,
4、基因工程在农业医药卫生领域的应用,细胞工程的主要内容,克隆技术,现代生物技术会打破生物物种间的平衡吗？,对转基因食物的担忧,我们是否要接纳克隆人？,1、现代生物技术重塑自然生命,现代生物技术的含义,生物工程也叫生物技术，就是以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他自然科学原理，按照预先的设计改造生物体，或利用微生物、动物体、植物体或其组成部分（包括器官、组织、细胞等）作为反应器对原料进行加工，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的技术。,现代生物技术的目的,对生物体进行改造，培育出具有优良品质的动物、植物、微生物新品系。 利用微生物、动物、植物为反应器对原料进行加工，生产出人类所需
5、要的产品。 进行疾病的防治、诊断和治疗。 环境污染的检测。,现代与传统生物技术的区别,现代生物技术通过操作基因来改变自然生命物质的原有结构和成分。显然，现代生物技术与传统生物技术已经有了区别，即它不再是在原有物种水平上和沿袭自然的途径，而是超越物种的界限，实现的是创造崭新的品种和有目的的改造和控制自然界已有的生化过程。,现代生物技术研究的主要内容,主要由以下5个分支组成： 基因工程(核心所在) 蛋白质工程(第二代基因工程) 酶工程 发酵工程 细胞工程,蛋白质工程,也称“第二代基因工程”，其主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成
6、，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。,酶工程,酶工程即利用酶的催化作用，在特定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。,发酵工程,发酵工程也叫微生物工程，是指利用微生物的特定性状，在生物反应器中生产有用物质的技术。 当前的医用抗生素、农用抗生素等已有数百种，绝大部分是发酵的产品。除抗生素外，发酵工程产品还包括氨基酸、工业用酶等。人们日常生活中广泛使用的味精、维生素等都是发酵工程的产品。,细胞工程,细胞工程是利用细胞
7、的全能性，在体外条件下，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，从而改良和创造新品种，生产人类所需要的新的生物类型。 细胞工程主要包括动植物细胞的组织培养技术、细胞融合技术、细胞核移植、细胞器摄取和染色体片段重组技术等。,细胞工程,细胞融合技术是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。 细胞器摄取主要是指叶绿体和线粒体的摄取。如用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；用抗药型草履虫的线粒体植入其他草履虫细胞，使后者获得抗药性。,细胞工程,染色体片段
8、重组是利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体等方法，获得新的染色体组合。 细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重要的意义。它的典型应用就是用于动物无性繁殖的“克隆”。,克隆技术,克隆也就是细胞核移植，即将一个细胞中的核经显微手术和细胞融合的方法移植到去核的另一个细胞中，重组胚胎发育至产仔的过程。 广义的说法就是动物不经过受精作用而获得新个体的方法，即无性繁殖。无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”。在技术上，科学家的“克隆”试验经历了从两栖动物的核移植到高等动物的核移植；从胚胎细胞核移植到体细胞的核移植的过程。,第一讲 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然
9、生命 2、基因工程的诞生与发展 3、基因工程的应用,2、基因工程的诞生与发展,（1）基因工程诞生的理论基础 （2）基因工程诞生的技术突破 （3）基因工程的诞生 （4）基因工程的基本概念与内容,A. DNA是遗传物质,1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。,1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。,（a）肺炎双球菌转化实验,（b）噬菌体转染实验,（1）基因工程诞生的理论基础,1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,B. DNA双螺
10、旋结构,1958年，Crick提出遗传信息传递的“中心法则”,DNA,RNA,protein,1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码,C. 中心法则和遗传密码,2、基因工程的诞生与发展,（1）基因工程诞生的理论基础 （2）基因工程诞生的技术突破 （3）基因工程的诞生 （4）基因工程的基本概念与内容,A. 限制性内切酶(restriction enzymes),1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,Ha
11、milton O. Smith 得到第一个限制酶,1978年Nobel生理或医学奖,（2）基因工程诞生的技术突破,B. DNA连接酶(ligase),1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。,C. 载体(vector),1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,D. 感受态体系,1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。,E. 琼脂糖凝胶电泳,1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。,F. DNA测序技术,197
12、5年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。,1980年Nobel化学奖,2、基因工程的诞生与发展,（1）基因工程诞生的理论基础 （2）基因工程诞生的技术突破 （3）基因工程的诞生 （4）基因工程的基本概念与内容,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：,A. Berg的开创性实验,将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。,（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）,（3）基因工程的诞生,B. Boyer-Cohen实验,1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因
13、的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen实验,Stanley Cohen 1986 Nobel生理或医学奖,Herb Boyer,2、基因工程的诞生与发展,（1）基因工程诞生的理论基础 （2）基因工程诞生的技术突破 （3）基因工程的诞生 （4）基因工程的基本概念与内容,（4）基因工程的基本概念与内容,A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术
14、与基因工程的基本用途 D 基因工程的基本形式 E 基因工程的特征 F 基因工程的技术流程,A 重组DNA技术的基本定义,（4） 基因工程的基本概念与内容,重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,B 基因工程的基本定义,（4） 基因工程的基本概念与内容,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
15、术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,C 重组DNA技术与基因工程的基本用途,（4） 基因工程的基本概念与内容,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源,大规模生产生物活性物质,设计、构建生物的新性状甚至新物种,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程 蛋白质工程 途径工程,发酵工程 细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分 离 工 程,野生细胞,野生细胞,生物活性物质,生物活性物质,D 基因工程的基本形式,（4） 基因工程的基本概念与内容,第一代基因工程(经典基因工程)蛋白多肽基因的高效表达 第二代基因工程(蛋白质工程)蛋白编码基因的定向诱变 第三代基
16、因工程(途径工程)代谢信息途径的修饰重构 第四代基因工程(基因组工程)基因组或染色体的转移,通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良。,a. 打破物种的界限,b. 定向改良物种,转移外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,（4） 基因工程的基本概念与内容,E 基因工程的特征,c.可以创造出自然界中原本没有的生物,b. 载体的准备,a. 目的基因克隆,从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和扩大繁殖获得足够量的目的基因或cDNA 序列。,（4） 基因工程的基本概念与内容,F 基因工程的技术流程,选择合适的载体，并对载体DNA 进行克隆，制备足够量的达到一定纯度的载体DNA 。,
17、将重组体(载体)转入适当的受体细胞中。,c. 目的基因与载体的连接,F 基因工程的技术流程,选择适当的克隆策略，将目的基因连接于载体的多克隆位点或启动子和终止子之间，实现DNA重组。,d. 重组DNA 转化/转染,f. 重组体的大量培养、外源基因表达效应分析与开发应用,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物，对外源基因的表达蛋白进行分离与纯化并进行后续结构与功能的研究。,e. 重组体的筛选与鉴定,挑选转化成功的细胞克隆(含有目的基因)。,G 基因工程的基本条件,目的基因 载体 工具酶 宿主细胞(受体细胞),H 基因工程的技术策略,强化基因的表达，改善生物性状 关闭特定基因的表达，改
18、善生物性状 基因的异源表达赋予生物新的功能,3、基因工程的应用,（1）基因工程在农业生产中的应用 （2）基因工程在工业中的应用 （3）基因工程在医药上的应用 （4）基因工程在环境保护中的应用 （5）基因工程技术的商业化发展,A. 提高植物的光合作用效率,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（a）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（b）提高光能吸收率和转化率,（1）基因工程在农业生产中的应用,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,B. 提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质
19、性状(高产、稳定、优质、抗虫、抗病等)。,C. 转基因植物,（1）基因工程在农业生产中的应用,转基因番茄,转基因胡萝卜,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,D. 转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物(TPA)和尿激酶的转基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,（1）基因工程在农业生产中的应用,转基因鱼,转基因鱼,转基因蚕,2001年1月11日，世界上首例转基因灵长类动物转基因猴“安迪”在美国安全降生,
20、2004年，美国科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶。,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,A. 纤维素的开发利用,B. 酿酒工业,（2）基因工程在工业中的应用,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech (Genetic Engineering Technology)。,第
21、一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,（3）基因工程在医药上的应用,Genentech的骄人业绩,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）,大肠杆菌或酵母菌生产激素(如胰岛素)、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,A. 用转基因植物或动物生产药物,B. 用微生物生产药物,C. 设计高效高特异性的生物制剂,D. 研制疫苗,F. 法医鉴定,G. 基因治疗,E. 基因诊断,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,(仍在探索阶段),医药,药物基因组
22、学,人工设计,克隆P450s,疾病的动物模型,治疗性小分子,植物,微生物,诊断用蛋白,治疗性蛋白,微生物,动物,疫苗,植物,微生物,治疗性核酸,基因治疗,基因修复,反义药物,DNA疫苗,诊断性核酸,遗传病,传染病,美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）,1,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,A. 检测水污染,B. 生物降解,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,（4）基因工程在环境保护中的应用,生物技术的发展在某种程度上是由商品经济 的发展所推动的。,Genentech公司1980年上市后20分钟内由35$涨到89$/
23、股。,A. 商业投资支持现代生物技术研究,1980-1983年，美国成立了200多家生物技术公司。1985年400多家，1300多家。 现在几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。,（5）基因工程技术的商业化发展,B. 基因工程商业化特点,a. 技术密集型,（i）产品来源于实验室,Boyer教授是Genentech的副总裁。,（ii）科学家往往就是公司的领导人,1994年仅美国的总销售额40多亿美元。 1992年日本4000亿日元。 20世纪末6000亿美元。,b. 市场扩张迅速,美国1993年40多亿美元。 日本1997年5000多亿日元。 80年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的Alle
24、lix生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,c. 投入巨大,d. 风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,我国在“七五”和“八五”计划的10年间，仅就“基因重组人生长激素”一个项目的研发就先后投入了近1.5亿元人民币的经费。这仅仅是一个仿制型的二类新药，而且又仅仅是制药工艺的研发。长达10余年的研发过程，巨额资金的投入，最终也并未获得高质量的“国产二类新药”。,全世界只有不超过100家生物技术公司有自己的产品。其中真正盈利的公司很少。,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,已取得的成果中60%是医学领域的。,g. 医学生物技术产业进展最快,f. 研究专一、产品专一,h. 专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,e. 产品不断增加,基因工程不是发现，而是创造。,基工的魅力,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,学习基因工程的方法,掌握基础理论和基础知识重要前提 理论联系实际重要方法 培养和树立辨证的思维和系统的方法论重要保证,OVER,
