1、我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出 3 个单菌落,我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己的经验.欢迎大家以此帖为引展开 “平端连接”讨论！ 我曾经作过跟你类似的实验。1）目的片段和载体的质量最好高一些。2）按照常规连接体系进行，一般 20ul 体系。3）连接温度 20-25 度。由于平端连接不涉及粘性末端的互补，所以温度可以高一些。4）酶的用量不要过量，按照说明就可以。5）连接时间至少 4h，能过夜就过夜。6）转化的时候：休克后加入培养基，孵育 50min，最多不超过 1h，转速
2、不要高，大约 150-170rpm。然后稍加离心弃去上清，留下大约 200ul涂板子就可以了。 在我的平端连接试验中，我曾经尝试过将目的片断抽真空变成干粉后，以较小体积重新溶解后再与目的载体连接，我觉得这样效果也不错。另外，平端连接反应最好在 16 度环境中过夜。 1) 提高目的片段浓度无论对于粘性末端或者平端连接都是很有促进作用的；2）就连接的温度而言，一般粘性末端选择 16C，而平端连接选择 20-25C，我特地查了一下，NEB 公司的平端推荐温度也是 2025C。连接的过程中涉及大量个事件：粘性末端突出部分的退火互补；两端序列 5-3之间在连接酶的作用下进行连接。两个事件互相促进。在粘性
3、末端连接中，2 种因素都起作用。但是，连接酶的最佳活性温度是 37C，退火互补需要温度降低，连接酶发挥作用需要温度提高，所以就权衡一下，实践摸索 16C 是粘性末端的最佳连接温度。平端连接中，不存在粘性末端那样突出序列要互补的问题，所以要尽可能的照顾连接酶的活性。那为什么不用 37C？因为这个时候虽然酶的活性较好，但是不利于片段和载体之间的相互碰撞。所以，还是选择了 2025C。 screen.width-333)this.width=screen.width-333“ width=139 height=139 title=“Click to view full my.JPG (139 X 1
4、39)“ border=0 align=absmiddle 有启发！多谢！ 我的经验是 :1， 平端连接需要过夜反应。2， 插入的 DNA 片段的摩尔数是载体摩尔数的 5-10 倍，这个很关键。载体通常 50ng 就够了，若你的载体在 10k 左右，可用 50100ng.3， 若你的载体很大，建议你用电转化。而且电转化前要纯化连接产物。 先谢谢楼上各位的指点，对我大有启发，我再重新做一次，希望能有好的结果。还有一个问题请教各位，补平之后，是否需要先回收再去磷？还是补平后直接加 BUFFER 和 CIAP？ 如果补平后回收，然后 CIAP，然后再回收，载体处理的更干净，可是会有损失。通常我是补平
5、后用纯化试剂盒纯化,之后做 CIAP, 然后跑胶回收。总之，1： 补平后不可直接做 CIAP。至少要纯化后再 CIAP。2： CIAP 后一定要跑胶回收处理，因为这是连接前的最后一步，一定要干净。 关于平端连接的一点点补充：优点没有连不上的，只有切不开的！平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条 DNA 序列都能连接在一起，当然需要 ligase 的酶学作用了。这个不同 DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到 5或者 3突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。另外，有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的
6、克隆工作提供了一种机会。缺点1）连接效率比粘性末端低连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的 T4DNAligase 对于平末端的 Km 值比粘性末端高 1000 倍。2）可能产生双向插入由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。3）可能多拷贝插入平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释
7、。一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。 各位大侠：我现在在做三段连接，两段目的基因中一个用 EcoRI 和 BspTI 双酶切，有 1.8Kb；另一个基因为 100bp 的片断，用 NotI 和 BspTI 双酶切。载体大片段用 EcoRI 和 NotI 双酶切，将他们放入一个连接体系里面连接，结果什么也没转化出来！郁闷啊！请问各位，怎么安排两个目的片段的比例？我用的酶是晶美的 MBI 的酶，而宝生物说我的 BspTI 酶切虽然是粘端，当时连接效率低，要用平端的连接条件，请问对于粘端采用平端条件应该怎么做呢？我是新手，希望各位前辈不吝赐教！还有，我如果先将两个目的片段连接，再和载体连接，
8、那样效率是不是会高点呢？To mybbff：你以前做成功三段连接，你用的体系大概是什么？我的目的片断是 100 微升 PCR 产物 纯化为 40 微升，再全部酶切后，纯化用 15 微升 TE 溶解，你看这个浓度做三段连接够了吗？现在真是很郁闷！找不到原因，不知道该怎么改进！希望你能多给些建议！不甚感激！ To：yywwrm 1）实验中没有什么是死的，都需要具体的去摸索。2）DNA 浓度越高，分子末端的碰撞几率越高，连接的成功率越高。但是， DNA 末端之间也存在竞争，所以 DNA 的浓度对于连接产物的形成也有很重要的影响。3）建议适当提高小片段浓度，适当降低大片段浓度。4）我的做法是，如果有下
9、一步工作（除了转化）， DNA 最好不用 TE 溶解，而是用 55C 预热的 DDW 溶解。5）实在不行，可以先连接其中一个目的片段，再连接第二个目的片段，分步作，可能成功率高一些。这样如果多克隆位点不方便的话需要利用中间载体进行倒换。Good luck! screen.width-333)this.width=screen.width-333“ width=139 height=139 title=“Click to view full my.JPG (139 X 139)“ border=0 align=absmiddle 谢谢你！mybbff！你说的先连接其中一个目的片段，再连接第二个目
10、的片段，分步作，是不是就是先把一段载体克隆进我的表达载体。然后再把另一段基因克隆进去？室这个意思吗？ yywwrm wrote:谢谢你！mybbff！你说的先连接其中一个目的片段，再连接第二个目的片段，分步作，是不是就是先把一段载体克隆进我的表达载体。然后再把另一段基因克隆进去？室这个意思吗？你说你是三片段连接，那么就是 2 个目的片段和 1 个载体。我的意思是你也可以这样做：1）把目的片段 1 连入载体 A，构成重组质粒 B，然后把你的目的片段 2 连入重组载体 B，就构成了你最终需要的质粒 C。那么在质粒 C 中就同时含有你的 2 个目的片段。2）但是，我猜测你之所以要用三片段连接，可能上
11、面那样做多克隆位点不方便，那么你可以先按照上面说的把目的片段 1 和 2 分别克隆到其他一个合适的载体，然后把 1 和 2 一起再亚克隆到你最终要用的那个载体。也就是中间转换一下载体。不知道你明白了没有？ screen.width-333)this.width=screen.width-333“ width=139 height=139 title=“Click to view full my.JPG (139 X 139)“ border=0 align=absmiddle 你的意思我明白！谢谢啦！我再试几次，刚两了一次，呵呵！如果再不行就只能换方法了！ 1.平端连接用宝生物的酶需要 16
12、度用 NEB 的酶 22 度过夜反应。2. 插入的 DNA 片段的摩尔数是载体摩尔数的 3-10 倍，这个很关键， 10K 载体通常 50ng-100ng 就够了。3. 热激转化要比电转化的效率大 10 倍，有条件的建议用电转化。 4.载体酶切后跑胶回收，CIAP 后只要用氯彷处理回收即可。 spring333 wrote:3. 热激转化要比电转化的效率大 10 倍，有条件的建议用电转化。 4.载体酶切后跑胶回收，CIAP 后只要用氯彷处理回收即可。3. 逻辑不对吧？4. 载体酶切后，如果切掉的是一个大片段，应该电泳回收；如果切掉的只有几个碱基，完全可以利用纯化柱子回收，更快；CIAP 处理后
13、，最好不要用氯仿处理回收，一样可以利用纯化柱子去除蛋白回收，更快，更方便，更重要的是避免了氯仿处理不好对后续试验造成的可能影响。 推荐：使用 PCR 上使用温度循环连接，其实温度高的时候 DNA 分子热运动剧烈，并不利于连接；温度低的时候 ligase 的效率又降低！所以推荐使用高浓度的 ligase、PEG、和温度循环连接！具体可以大家可以查查，我记得是这样，时间长有点忘了！ 看了上面各大侠的经验，的确有所启发，但是我有自己的一些 TRICK，屡试不爽！请指教A. 如果是先补平或切平粘性末端再连接，效率不会高，主要是因为补平或切平的效果不好，得到的转化子多是自连，本人的方法是，先用 Klen
14、ow酶处理，马上再用 T4 聚合酶处理，这样处理得到的平端几率较高B. 连接酶的处理温度每个公司并不一样，要参照各公司的说明书，我一般用 Promega 的，效果不错，16 度过夜，注意酶、片断浓度要高，载体浓度可以低一点C. 我个人认为 CIAP 处理后最好用苯酚氯仿纯化，因为 CIAP 会跟 DNA 末端紧密结合，光靠凝胶回收是去不掉的，它会极大影响后面的连接。可能你会觉得最后的得率很低，不过请放心，只要小心点，沉淀下来得核酸足够做克隆。最后给大家我的完整平端连接步骤：（以 20ul 酶切完后的体系为例）1。如果要补平或切平请先将样品置于 70 度水浴 10min，然后体系放大到 50ul
15、，其中按照说明书加入所需 klenow buffer 和酶，以及 BSA 等。常温反应 10min 后将反应物置于 37 度水浴，再加入 T4 聚合酶，反应 5min。2。凝胶回收处理的载体或片断3。CIAP 处理4。苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收5。连接反应祝大家平端连接成功！ 有没有设对照？在做正式的连接转化之前或者同时，要先做阴性阳性对照。如果阳性（质粒）对照不长或数量比较有限，说明感受态有问题，或者是转化技术，或者培养基。但感受态的质量是最值得关注的。即使质粒对照长得过得去，对于做你这个连接也不一定能满足要求。很重要啊。如果是阴性对照（只有处理好的载体，没有加片段。）长了菌，而且长的和你的
16、正式实验组数量没有很明显的差别，那你根本不用费力去做鉴定了。这是在之前的环节出了问题：酶切不完全；跑胶没有跑开； 连接酶的质量一定要好，PROMEGAR 和 NEB（有个五分钟快速连接试剂盒我用过还可以）都较好，如果有罗式的快速连接试剂盒那更好了，但要1500 块，而且要等个把月才能到货。另外，我们实验室的牛人说平端连接可以在 16 度若干小时或过夜，然后低温（4 度）长时间（22 小时左右）再转化。我没有这样做过，但我觉得你可以考虑试试。尽量把各个环节优化吧，剩下的就是多尝试了。真做不出来也是可以理解的。祝你好运！ 我做过这个类似的连接的,我是目的片断用大 K 片断补平,然后电泳回收.载体就
17、直接酶切回收 .我没有进行去磷酸化 .在 16 度过夜连接, 总体系 12 微升,其中 1 微升 T4 酶.当然目的片断和载体的比例我用摩尔比 1:8,这样目的片断就比较多.转化, 我长了有一板子,然后就是大通量的删选.每次 12 个菌落,我搞了 3 批,还算运气好,重复到第三次,终于弄到了一个.当然, 我这是笨办法,没有用 PEG,也没有去磷酸化.累了一点.但效果还可以. 就是自连太多 还有个方法啊 ,你可以试试看,把连接产物直接跑电泳,然后找到你要的大小的片断,然后切胶回收.这样删选就很方便了.我试过直接把胶在 PCR 仪里 55 度溶胶,然后把熔解的胶直接转化.也能长细菌. qkyzu
18、请教一下:连接体系一般很小，跑电泳能够看见连接上的产物吗？那个量一般很小啊！好像电泳检测是看不见的，那怎么割胶呢？希望能指点，我做了结果看不见啊！多谢！ 各位大侠好, 看了大家的讨论, 真是受益非浅。我现在做的平端连接是用 PCR 扩增出的两个片段，一个是 1000bp，一个是 200bp，都是平端，用的是宝生物的 pyrobest 酶。现在我把这两个片段凝胶回收了再连起来。可是我怎么都连不上，我用的连接酶是宝生物的 T4DNA 连接酶。我作了好长时间了，真是郁闷，大家有什么高招能帮助我。谢谢各位了，请多指教。 我看过 banbandama 关于平端连接的困难,我个人认为之所以连接效率低 ,可
19、能是磷酸化的问题,因为你要知道你在补平的过程中,KLENOW 酶它会在 3端多出一个碱基, 本身可能就会影响你的连接效率, 再加上你去磷酸化 ,如果去磷酸化程度掌握不好, 可能都连接不出来。你已经相当不错了。我觉得你已经是专家了。我个人的经验认为，在补平后，可以不去磷酸化，用一个比较理想的载体：片段比例（用这种比例降低自连的机会），连接效率会提高不少！愚见而已，不知对你是否还有帮助！李自青，我查了你用的 PYROBEST 酶。请你仔细查看的它的性质，你会发现，如果你的引物 5末端没有进行磷酸化修饰的话，你的片段可能 5端也没有磷酸化。平端连接很困难，如果你的两片段都没有 5磷酸化的话，连接更困
20、难。我建议你 5磷酸化处理后（用 T4 激酶），再连接试试。另外，我提醒你，你一定注意两个片段的比例。 yywwrm 不是吧?连接体系要达到20ng/ul, 才效果比较好,我们电泳 10ng 就能肉眼分辨了.所以 12ul 体系应该有不少 DNA 的.还有你可以多连几管并起来跑 .当然一般你不需要用这个方法的,其实删选的过程也是很刺激的. benbendanma wrote:我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出 3 个单菌落,我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己的经验.欢迎大家以
21、此帖为引展开 “平端连接”讨论！建议提高载体及插入片断的浓度。 我做一个三段连接，把两段基因和载体大片段连接做融合表达！就是我上面提过的！我做了三个体系：第一个体系是先把两段目的基因放在一起连接，没有纯化再加入载体大片段连接转化，第二个体系是先加载体大片段和小基因连接，不纯化再加入大基因连接，第三个体系是先加载体和大基因连接，然后直接加入小基因再连接，然后用所有的连接也液转化！结果每个体系都转化出来 1 到 2 个菌落。可是我一鉴定发现基因并没有转化进去，看上去和我的空质粒一样大，这就很奇怪了，我前几次是直接将三段放在一起连接然后转化，结果并没有出现菌落，这说明我的载体没有自连，而且我的载体是
22、不同的酶进行的双酶切，应该不会产生自连！可不是自连又没法解释了？还有我的第二个体系和第三个体系转化出来的结果更让我不明白，抽提出来的质粒竟然比我的空质粒还小，竟然跑在我的空质粒的前面！请问各位大虾能帮帮我！不甚感激！注：我的载体大片段有 9.2Kb，大基因有 1.73Kb，小基因为 100bp！ yywwrm wrote:我做一个三段连接，把两段基因和载体大片段连接做融合表达！就是我上面提过的！我做了三个体系：第一个体系是先把两段目的基因放在一起连接，没有纯化再加入载体大片段连接转化，第二个体系是先加载体大片段和小基因连接，不纯化再加入大基因连接，第三个体系是先加载体和大基因连接，然后直接加入
23、小基因再连接，然后用所有的连接也液转化！结果每个体系都转化出来 1 到 2 个菌落。可是我一鉴定发现基因并没有转化进去，看上去和我的空质粒一样大，这就很奇怪了，我前几次是直接将三段放在一起连接然后转化，结果并没有出现菌落，这说明我的载体没有自连，而且我的载体是不同的酶进行的双酶切，应该不会产生自连！可不是自连又没法解释了？还有我的第二个体系和第三个体系转化出来的结果更让我不明白，抽提出来的质粒竟然比我的空质粒还小，竟然跑在我的空质粒的前面！请问各位大虾能帮帮我！不甚感激！注：我的载体大片段有 9.2Kb，大基因有 1.73Kb，小基因为 100bp！1）我个人认为，你这三个体系还不如三个片段一
24、块连接好。先是两个片段连接，然后再和第三个片段连接，也就是说有两次连接反应，表面上看起来连接反应应该很充分，但是有一点不知是否应该注意，那就是连接温度一般选择 16C，那么这么长时间 DNA 处于 16C 的环境里面，而且你的连接混合物里面不能保证完全的无菌或者其他因素不影响 DNA 的稳定性，所以我觉得反而可能有些不妥。2）我的建议还是以前那个意思，适当提高小片段的浓度，三个片段一起连接，虽然你的另一个片段和载体都很大，实验存在一定的难度，但是我觉得这样也不是一定不行。3）另一种建议：先把小片段和载体连接（这种连接应该是比较容易的），构成一个新的载体，然后再用这个新的载体和那个大片段连接就可
25、以了。这种办法中都是两个片段连接！如果没有方便的酶切位点，实在不行找一个中间载体转换一下。 mybbff 谢谢你的建议！我做过两次三段一起连接的体系，结果什么也没有转化出来，就是白板。而且我的小片断浓度还是挺高的，因为我加的和大片断一样多，电泳他们的亮度也相似，这样我的小片段的摩尔数肯定要比大片段多很多了，哎，按理说应该可能会转出来的，可没办法，做了几次都没出来，老板又让这学期必须要作出来，所以很急！你看我可不可以设计 34 条引物，把我的小基因通过加端 PCR 把他 P 到大基因上？一般加端多少没有问题？我设计的引物是有 20 个配对，抛端 20 几个碱基，这样可否 P 出来？ mybbff
26、 wrote:3）另一种建议：先把小片段和载体连接（这种连接应该是比较容易的），构成一个新的载体，然后再用这个新的载体和那个大片段连接就可以了。这种办法中都是两个片段连接！如果没有方便的酶切位点，实在不行找一个中间载体转换一下。1）你说的那个办法我没有试过，不敢肯定！设计的引物有 20 个配对，抛端 20 几个碱基，记得文献上好像有过，可以试一试。2）能不能考虑一下我的这个建议，当然只是建议了。因为我考虑到，如果单纯的转换载体就只是用到酶切连接，对于序列没有影响；而如果用 PCR的话，到时候肯定涉及到序列保真性的问题，当然，你的序列比较短，可能不会有问题。 mybbff真的很感谢你！我今天又做
27、了一个方法，就是我的大基因和我的小基因用相同的酶切，然后让他们连接过夜，明天处理一下，取 15 微升跑电泳，看是否连接上；另外直接取部分连接液作为模板，进行 PCR，把连接上的产物扩增，如果扩增不出来的，而且电泳不看见，估计就是这两段基因之间连接不上或者效率太低！您看我的这个方案可行吗？还需要有什么注意的！-我现在是多手准备，又头绪比较乱，希望你能给我多提些意见！谢谢！ yywwrm wrote:我今天又做了一个方法，就是我的大基因和我的小基因用相同的酶切，然后让他们连接过夜，明天处理一下，取 15 微升跑电泳，看是否连接上；记得在别的论坛里看到有人这样做过，我不知道结果会怎么样。能看到吗？我
28、真的不敢确信！不过我当初带学生的时候给学生出考试题有过这么一道题（不知道你是不是我当初那些学生中的一个？呵呵），但是由于我不敢肯定，所以就只是让学生说说理论上会怎么样。另一方面，我觉得就算你的大小片段连在一起了，那么在你把这个产物作为 insert 与 vector 连接的时候浓度还是可能有些太低，效果不一定就好！你还是试一试看。yywwrm wrote:另外直接取部分连接液作为模板，进行 PCR，把连接上的产物扩增，我只能说理论上是可行的，但是我担心连接上以后，在你做 PCR 的时候第一步因为有一个 94C 变性的过程，那么两个片段连接的紧密程度是否能经受得住这个变形的温度，恐怕谁也不知道。
29、所以，我还是只能说让你试一试。太遗憾了，看来我做的实验太少，至少碰到的问题太少因而没有积累到足够的经验，不能给你具体肯定的帮助！目前，根据你的结果（当然我不知道你的具体实验），我比较倾向于采用中间载体的转换的方法。当然，你可以跟你们实验室的 GGJJ 们具体的商量探讨！祝愿你实验成功！ yellowhair,非常感谢你给我的建议,我现在也正在怀疑我的引物 5末端是否磷酸化,我打算做进一步处理 mybbff wrote:我只能说理论上是可行的，但是我担心连接上以后，在你做 PCR 的时候第一步因为有一个 94C 变性的过程，那么两个片段连接的紧密程度是否能经受得住这个变形的温度，恐怕谁也不知道。连接好以后可以经得住 90 度变性。因为连接酶连接不是“给衣服打补丁”，同一个化学键没有新旧，好坏之分
