1、体内 -MMC-PEG 的抗肿瘤和病理学变化主 要 研 究 内 容 ： 将小鼠乳腺癌细胞 EMT-6 接种于 BALB/C 小鼠，通过观察相对肿瘤体积、最终的肿瘤重量、肿瘤 H&E 染色和 TUNEL 染色图片来评估-MMC 和 -MMC-PEG 结合物的抗肿瘤效果；通过观察小鼠体重变化和肝脏、肾脏组织的 H&E 染色图片和 TUNEL 染色图片用于评估 -MMC 和 -MMC-PEG 结合物对小鼠的毒性。主 要 研 究 结 果 ： -MMC高、中、低剂量组的最终肿瘤重量分别为阴性对照组的36.10%、 54.34%、73.96% ，-MMC-PEG结合物治疗组分别为阴性对照组的25.55%、
2、47.39%、69.72% ，提示-MMC经PEG修饰后，抑制肿瘤活性没有受到明显的影响；-MMC经PEG修饰后，对动物的毒性有明显降低的效果。1 实验方法1.1 预实验雌性 BALB/C 小鼠 16 只，体重 202g，购于四川大学实验动物中心（合格证书：医动字 24101108 号） 。饲养条件为温度 232，湿度 5010%，光照昼夜交替循环，实验期间饲料和水自由供应，饲养观察 2d 观察正常则用于实验。每只小鼠于其右前腋下注射 3106 个细胞，随机分 4 组每组 4 只，分别作为阳性组、阴性组、-MMC 组和 -MMC-PEG 结合物组。于接种肿瘤细胞的次日给药，阴性组 0.2 ml
3、 生理盐水，阳性组 0.5 mg（0.2 ml）表阿霉素，-MMC 组和-MMC-PEG 结合物参考资料初步定为 4 mg/kg（ 0.2ml）的剂量，隔天一次，总共给药 10 次。观察小鼠的生长情况，隔两天称重记录，肿瘤长出后用游标卡尺测量大小并记录，一周两次到实验结束。处死小鼠，剥取肿瘤块称重记录。结果 -MMC 组虽未死亡但是中毒现象明显，而 -MMC-PEG 结合物中毒症状明显减轻。因此正式实验则选择 2.5 mg/kg 为高剂量组。1.2 抗肿瘤实验按常规方法大量培养小鼠乳腺癌细胞 EMT-6，以 3106 数量接种于小鼠右前腋下，接种日定为第 1 日，次日将 BALB/C 小鼠随机
4、分为 8 组，每组 8 只。设置测试组 3 组：高剂量组(2.5 mg/kg 体重) 、中剂量组(0.5 mg/kg 体重)和低剂量组(0.1 mg/kg 体重)，每只小鼠以腹腔注射途径被注射 0.2 ml -MMC 或和 -MMC-PEG 结合物；阴性组每只小鼠注射 0.2 ml 生理盐水，隔日一次，共注射10 次。实验第 2 日阳性对照组每只小鼠仅通过尾静脉一次注射 0.2 ml 含 0.5 mg表阿霉素的生理盐水溶液(Epirubicin，一种临床上治疗乳腺癌的化疗药物)。待瘤块长到可用游标卡尺测量时即测定瘤体的长轴和短轴用以衡量瘤体大小，每 3 天一次，同时测定小鼠的体重并记录。瘤体大
5、小按下列公式计算：相对肿瘤体积(mm3)=a 2 b0.5，其中 a 代表瘤块短轴的长度（ mm） ，b 代表瘤块长轴的长度（mm） 。于第 21 天实验结束日脱颈处死小鼠，并剥取肿瘤块称重后立即浸入 10%的福尔马林溶液中固定。同时剥取小鼠重要脏器肝、肾、心、脑、肺等一并浸入固定液中，务必使组织完全没入固定液中，并于第二天换一次固定液保证组织样品的固定效果。1.3 组织切片的病理图片观察（H&E 染色和 TUNEL 法）固定好的组织样品做石蜡组织切片用于后续的 H&E 染色和 TUNEL 法原位细胞凋亡检测。0.5 m 厚度的石蜡切片按常规方法制作，并进行 H&E 染色后拍照观察。TUNEL
6、 检测按照试剂盒的操作进行，标记反应后尽快于荧光显微镜下观察并拍照。2 实验结果与讨论2.1 -MMC-PEG 结合物降低对动物的毒性采用非特异性毒性实验，通过外表观察，测量体重变化情况以及病理组织学检查作药物毒性的评判指标。 本实验中，第 3 日也就是首次注射药物的次日，-MMC 高剂量组和表阿霉素组小鼠外观体征表现出中毒症状，如毛发竖立，身形萎缩，行动变迟缓甚至蜷缩发抖等。药物的毒性也存在剂量依赖性和时间依赖性（图 5.1a） ，随给药次数的增加，-MMC 高剂量、-MMC 中剂量、-MMC-PEG 结合物高剂量组和表阿霉素组小鼠的体重减轻量增加。实验结束日测得 -MMC 高剂量组、-MM
7、C 中剂量组小鼠平均体重比初始日分别降低了 3.32 g 和 1.0 g，而 -MMC-PEG 结合物高剂量组则降低了 0.8 g，表阿霉素组小鼠体重减轻 3.27 g。如图5.1b 所示，-MMC 高剂量治疗组和表阿霉素治疗组的小鼠肝脏病变严重，表现为肝细胞水样浊肿，胞质起泡，胞质膜微绒毛减少，部分区域呈现脂肪样变。而 -MMC-PEG 结合物高剂量治疗组的小鼠肝脏只表现轻微病变，阴性对照组小鼠的肝脏细胞轮廓清晰，细胞质和核内部分未见异样。图 5.1c 可看出 -MMC 高剂量治疗组和表阿霉素治疗组的小鼠肾脏组织产生明显病理变化。表现为肾小球膨胀并紧贴肾小囊，胞外基质增生，肾小管腔扩张，蛋白管型充填其中，肾小管部分区域出现透明化变性甚至纤维变性。而 -MMC-PEG 结合物治疗组小鼠的肾脏组织仅表现轻微程度的病理变化。说明 -MMC 经 PEG 修饰后，对动物的毒性明显降低。
