1、高通量药物筛选模型 *姚佳 杨建波 杨洁*（南京大学生命科学院生物化学系，医药生物技术国家实验室，南京 210093）摘要： 本文介绍了可用于药物筛选的三种新的快速高通量筛选方法，包括基于反酵母双杂交的筛选系统；细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理，应用情况和有缺点进行了阐述。关键词： 高通量筛选（HTS） ，酵母双杂交，靶点，受体Abstract: This article mainly deals with three new dominant plat forms of HTS(High-Throughput Screen) which are fairly
2、useful in drug screenthe reverse yeast two hybrid system, the cell-based screen and the animal platform, including their principles, their appliance and their advantages together with disadvantages. Key Words: High-Throughput Screen, yeast two-hybrid system, target, receptor 学科分类号：Q7 药物筛选模型研究经历了三个不同
3、的发展阶段：最初意义上的筛选方法、分子生物学筛选方法和高通量筛选方法，而每一个阶段都源于一种新技术的诞生。最初的药物筛选是直接利用动物组织或天然产物进行的，并不涉及到疾病发生的分子机制。在这样粗略的筛选系统中只有有限的样品得到筛选，而且大多数样品只是基于疾病表征而非靶点的筛选。因此，药物的发现会带有偶然性。1980 年以来，随着有机化学和分子生物学的发展，更加系统化的筛选方法应用到药物研究与开发中。一方面，有机化学的飞速发展为筛选提供了庞大的人工合成小分子库；另一方面，分子生物学为筛选提供了靶蛋白。通过比较正常人群与疾病患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功能，从而正
4、确地选择、描述并确认某些靶蛋白，有助于更加理性地进行药物筛选，不足的是上述过程往往费时耗财。而基因组学的发展对这个问题提供了很好的解决方法，基因组学能够更加有效地验证潜在的靶蛋白,并通过功能基因组研究能够快速有效地确认与特定疾病* 本课题为国家自然科学基金资助项目（项目编号 30171094 和 30271497） 。联系人：杨洁，南京大学生命科学学院，医药生物技术国家重点实验室，南京 210093，中国；电话：86-25-3594060，传真：86-25-3324605；Email：。有关的靶蛋白 1 。传统意义上的药物筛选方法一般包括精确定义某些具有选择性的靶蛋白、确定其中某些靶蛋白的生物
5、学性质以及体外药物筛选 2 。而基于化学基因组学的药物筛选则包括从基因角度广泛地确定靶蛋白，对其中的大部分靶蛋白进行高通量的化合物筛选，对其中有希望的化合物进行生物活性检测。使用该方法的优势在于能够提供更多的靶蛋白数据以利于进行庞大的化合物库的筛选，从而能够提高活性化合物的发现几率。由于组合化学和化学基因组学的迅猛发展，为药物筛选提供了大量的化合物库以及更多的靶点，这必然要求有高效快速的方法进行药物筛选，高通量筛选系统（High-Throughput Screen System，HTS ）的出现给药物研究者提供了一个快捷的途径。目前高通量筛选技术呈多元化发展趋势，可在以下三种平台上进行，即酵母
6、平台、细胞平台和动物平台。本文主要介绍这些模型的原理及其应用。1 基于反酵母双杂交系统的药物筛选模型酵母反双杂交系统是从酵母双杂交系统发展而来的新型药物筛选系统。酵母双杂交系统在研究蛋白-蛋白相互作用方面已经成为一种成熟有效的遗传学方法 3 。其理论依据是，许多序列特异性的转录因子通过结合到 DNA 上游激活序列（UAS）并在相应的启动子部位激活 RNA 聚合酶 II 从而提高靶基因底转录效率。DNA 结合和激活功能定位于 2 个互相分离的结构域内，分别称为 DNA 结合结构域（ DB）和 DNA 激活域（AD） 。与转录因子无关的蛋白与蛋白间相互作用使得 DB 和 AD 在空间上相互接近，从
7、而重组形成一个有功能的转录因子。因此，有功能转录因子的重组可以总结为 DBX 和 ADY ，其中的X、Y 可以是来自任何组织的蛋白质分子。将酵母生长标记例如 LEU2 或者 HIS3（分别参与了亮氨酸和组氨酸的合成）置于含有 DB 结合位点的启动子控制下，则 DBX 与ADY 的相互作用会产生选择性生长优势，从而在缺乏特定氨基酸的培养基上呈现小的菌落 4 。据此可以确定大量蛋白间的相互作用。反酵母双杂交是基于酵母双杂交基础上的一种新型的药物筛选方法。其理论基础与酵母双杂交基本相似，区别在于其报告基因不同，反酵母双杂交系统中只有在蛋白间相互作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势。在反酵母双杂交模
8、型中，野生型 DBX 与ADY 的相互作用将会导致对酵母细胞的细胞毒或者致死作用，因为在这个系统中报告基因是一些毒性标记基因例如 URA3（负选择） 5。在这个模型下，DBX 与 ADY 的彼此分离能够促成生长优势，从而能够很方便的验证一些相互作用缺陷型的等位基因或者一些阻断相互作用的小分子药物或者小肽（图 1） 2 。图 1 双杂交系统原理示意图。(a)-正向的双杂交系统 (b)-反酵母双杂交筛选 目前已经有多例成功报道，例如利用反酵母双杂交系统从人工合成的小分子库中筛选出了一些具有钙离子通道阻断活性的小分子 6。在这里，N 型钙离子通道的两个亚基 3和 1B-I-II 胞内 loop 被分
9、别融合到反酵母双杂交系统中的 Gal4 DB 和 Gal4 AD 中。利用CYH2 作为负选择筛选标记，该基因的启动子中包含有 Gal4 结合位点。在含有放线菌酮的培养基上，如果该报告基因表达将会导致酵母细胞中毒死亡。利用该系统在含有156000 个化合物的组合化学分子库中进行高通量筛选，发现其中有 10 个小分子显示出具有挽救放线菌酮敏感型的 DB3 与 AD1B 表达细胞的活性，获得了一个较好的抑制 N 型钙离子通道的活性小分子，并有可能发展成为一类新型的、有潜在治疗意义的钙离子通道拮抗剂。反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选系统，具有以下优点：1）该系统中的酵母细胞能够繁殖，因此无需
10、对靶分子进行耗时耗力耗财的生物纯化过程，而且能够在相对短时间内对大量的蛋白质进行测试。2）该系统是在一个生物体环境内进行的，因此与体内环境较为接近。细胞通透性以及细胞毒作用都作为参数在筛选过程中考虑。而这一点恰恰可以弥补体外筛选实验的不足。3）基于该系统的筛选能够比较准确地分析蛋白间的相互作用。利用几乎完全相同的步骤，不相关蛋白间的相互作用也可以进行测试。这就意味着许多蛋白间相互作用能够同时进行。4）该系统能够与现有的高通量筛选兼容，从而可以在 96 或 384 孔板上测试组合化学分子库中的化合物。另外它还很容易与计算机工作站等相结合，从而能够快捷地分析实验数据。尽管反酵母双杂交系统作为一种理
11、想的高通量筛选模型，具有很好的前景，但仍然存在一些缺陷，例如细胞膜通透性问题以及对药物浓度要求较高往往超出了组合化学所能提供的浓度等。目前正在进行多种尝试以改进这些缺陷，如通过改变酵母的基因型从而提高细胞膜的通透性 7，取得较为理想的效果。2 基于细胞平台的药物筛选模型与酵母系统相比较，细胞平台的药物筛选系统可以直接选取来源于人源组织的细胞或者是人源转化细胞株进行培养，更接近人体的情况，从而能够改善一些蛋白靶点在异源细胞中表达情况不够理想的局面。基于细胞的高通量筛选，能够提供化合物对于特定受体、离子通道或者是细胞内的药理活性，而传统的生化分析往往不能得到这些活性数据。例如细胞平台上的高通量筛选
12、能够区别药物究竟发挥激动剂作用还是拮抗剂作用或者是别构调节作用。同样，细胞平台的 HTS 也能够提供有关药物膜通透性以及毒性方面的信息 9-11 。细胞对于各种刺激能够产生显示的功能，例如基因转录、离子通道的开关、细胞增殖、细胞毒性、分泌、蛋白表达、酶活性改变等。这些性状的改变为检测提供了很好的目标。细胞平台上的高通量筛选过程如图 28所示。图 2 细胞平台上的高通量筛选主要过程的示意图目前基于细胞的高通量筛选经常采取三种以下方法。2、1 特定启动子操纵的荧光素酶报告基因在 20 世纪 80 年代，一些科学家就利用一些报告基因研究 cDNA 的 5端非翻译区，以确定参与基因转录调节的序列位置。
13、在随后的时间里，更多的报告基因被用于细胞平台上的高通量筛选如 G 蛋白偶联的受体（GPCRs） 、受体激酶以及核受体等。报告分析将一些靶点的生物学活性与一系列已确认的酶或者蛋白质表达相偶联，如氯霉素转移酶、荧素酶、分泌型生长激素、-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶、荧光蛋白、-内酰胺酶等等。这些酶或者蛋白提供了一个高度放大的信号，从而保证了系统的灵敏度。其中荧光素酶是高通量筛选最常用的报告酶类。在该系统中，将待研究基因的启动子或者启动子的部分元件与报告基因的编码区相连接。如果将一个合成的重复特定反应元件插入到报告基因的上游，还可以实现让该途径产生的信号分子对自身途径进行调节。该系统中一个成功的例子
14、是在单核巨噬细胞中有特定启动子驱动的荧光素酶报告基因表达 12 。该系统对于背景噪音信号具有很好的控制效果，而且对药物激动剂显示出计量效应；同时该系统对显示出对 DMSO（二甲亚砜）溶液高度的耐受性，并且能够产生稳定的信号。但是当化合物所表现出来的抑制剂活性与所设想的曲线相一致时，可能会产生假阳性。同时，若化合物具有细胞毒性也会导致假阳性。另外，对靶点远程的非特异性作用或者同一细胞内其他启动子对报告基因都会有干扰作用。GPCR 靶点的信号反应往往需要 4-5 小时，因此不能用于快速细胞反应的筛选并且很有可能对弱相互作用具有屏蔽效果。2、 2 GPCR-FLIPRtm-Ca2+反应系统这是一种监
15、测受体的信号转导途径的筛选系统，通常用来直接测量受体介导的 cAMP的聚集作用，或者通过测量细胞内 Ca2+ 浓度的变化情况来判定 GPCR 途径的活化与否 13 。在该系统中，通过 Gq 蛋白偶联的 GPCR 靶蛋白能够使细胞内的 Ca2+ 浓度明显上升，并且通过 Ca2+ 浓度敏感型的染色剂进行测定。FLIPR tm 是一种高灵敏度的信号收集器，该系统能够区别某些针对受体的微小作用，例如区别激动剂、别构调节以及抑制剂活性。缺乏受体或者 G 蛋白的细胞即使在使用激动剂时依旧不能产生可检测的 Ca2+ 反应。该系统也显出对化合物的剂量依赖性。同样这个系统也有所缺陷，例如 Ca2+ 以及一些能够
16、穿过细胞膜的化合物会导致激动剂筛选的假阳性也会干扰抑制剂分析。此外一些细胞即使没有G 蛋白，其内源性的其他受体也可以通过 Gq 蛋白进行偶联，诱导 Ca2+ 反应从而表现出激动剂活性或者对抑制剂活性筛选产生干扰。2、 3 转运蛋白放射性配体摄取测定当细胞转运蛋白与配体的结合非常复杂时，往往倾向于采用这一系统，例如针对氨基酸和神经递质的载体靶蛋白的筛选。该系统尤其适用于在结合分析中容易被忽略的变构调节作用。基于该系统的筛选分析常常是短时效分析，一般时间在 6090 分钟左右，因此化合物的毒性对细胞的影响可以被减小 14 。但某些类似于去污剂的化合物能够透过细胞膜，导致假阳性结果。随着分析仪器和实
17、验技术的进一步发展，已经有越来越多的靶点可以供细胞平台上的高通量筛选系统所选择，基于细胞的高通量筛选系统在药物发现及筛选过程中发挥了越来越重要的作用。图 3 是利用同基因组的人体癌细胞进行抗癌药物筛选的一个例子 15。系统通过特定荧光蛋白修饰的等基因细胞共培养系统筛选药物。图片描述了从 96 孔板上相邻 4 个孔中获得的数据。图中结肠癌细胞 DLD-1 中转入了一个表达黄色荧光蛋白的载体，而删除了突变的 K-Ras 等位基因的等基因衍生物细胞 KO 中则装入表达蓝色荧光蛋白的载体。这个细胞系的共培养物可以快速的检测化合物针对突变 Ras 基因型的药物活性，同时也包括相应药物毒性的检测。在检测的
18、 30000 个化合物中，一个全新的胞嘧啶类似物显示出了较高活性 15。图 3 细胞水平抗癌药物高通量筛选模型细胞共培养筛选。X 轴：药物加入后的时间，Y 轴：蓝荧光蛋白（BFP）和黄色荧光蛋白（YFP）的密度。3、基于动物平台的药物筛选模型基于反酵母双杂交的高通量筛选模型和基于细胞平台的高通量筛选模型均为体外模型，而有些药物虽然在体外模型中能够显示很好活性，但进入动物体内检测时活性却大大降低，甚至无活性。这主要是由于在人体或者动物体中，药物作用的发挥除了必须具备药理活性以外，还要考虑药物的 ADME 即药物的吸收、分布、代谢、排泄情况。药物在体内要经过吸收，分布代谢以及排泄等一系列的过程。有
19、些药物虽然具有很高的活性，但是由于本身的脂水系数原因，导致机体难以吸收，或者不能正确地分布到作用靶位点，从而活性急剧降低。而动物体模型是近年来刚刚发展起来的一种新型的药物筛选模型。由于动物体的完整性，使得该模型除了能够筛选药物的药理活性以外，还能够针对药物的 ADME 进行研究。虽然该模型目前还处于发展阶段尚未形成完善的系统，但是在针对某些疾病的研究方面已经显示出重要作用。例如在 Huntington 疾病的研究方面，小鼠模型显示了较好的效果。Huntington 病（HD）是一种常见的神经变性多发病。其主要的致病原因与 CAG 密码子的膨胀有关。在正常人中，CAG 三联体密码子的个数一般小于
20、 48 个，而在该病患者中，该数字远远大于 48 个，而且患者中该三联体密码字在遗传时不遵守遗传学规律，在每次传代时数量都会发生递增。CAG 密码子编码谷氨酰胺，随着 CAG 数量的不断增长，多聚谷氨酰胺片断不断产生，从而导致控制记忆、动作以及行为脑部细胞的死亡，产生Huntington 疾病 16 。目前对于该病尚无有效的治疗方法。最近一个日本的研究小组建立了一个关于该疾病的小鼠模型用于筛选有效药物 17。他们分别饲养了 2 个小鼠种系，第一个种系包含有位于钙调蛋白激酶 II 启动子 (CamKII)控制下的四环素反式激活因子(TetAct)。TetAct 是四环素应答抑制子与单纯疱疹病毒
21、VP-16 转录激活因子中转录激活域的融合蛋白。TetAct 结合到四环素应答操纵子序列并且激活与之相连接的基因。 第二个老鼠种系包含一个被删减了的重组 HD 转基因(CMV-TetO-HD)。该整合基因仅仅包含了人类 Huntington 基因的第一个外显子，该外显子含有 94 个 CAG 序列重复，并且能够被包含有四环素应答型操纵子序列（TetO ）的巨细胞病毒启动子(CMV)所驱动。两个小鼠系杂交的后代包含有上述两种转基因，并且能够进行对 HD 转基因表达的抗生素调节。在子代小鼠的饮水中加入能够与TetAct 结合的四环素衍生药物强力霉素（ Dox） ，从而导致 TetAct 与 Tet
22、O 的解离。由于TetAct 是 CMV-TetO-HD 表达所必须的，它的解离能够抑制毒性 Huntington 基因产物的产生，达到关闭该基因的效果。当 Dox 从饮水中除去时， TetAct 与操纵子结合，从而导致毒性 Huntington 基因产物的产生。可以想象，利用该模型可以进行具有封闭 Huntington 毒性基因效果药物的筛选。在饮水中加入不同的候选化合物，如果小鼠服用后无疾病症状，则表示该化合物可能具有活性；若小鼠依旧出现病征，则排除该种化合物。而且由于小鼠模型的介入，药物的毒性以及药物代谢（ADME）等多方面的因素都已经作为参数进入药物筛选模型中。用该方法筛选出来的药物比
23、体外实验所得出的活性化合物更有可能能够通过下一步药物筛选过程。尽管动物平台上的模型系统仍然处在初始阶段，可以想象该系统进行进一步完善后将具有前所未有的优越性，在药物的高通量筛选方面将发挥更大的作用。 4 展望在后基因组时代，基于靶点的高通量筛选(HTS)已经称为药物开发计划中重要的一个部分。随着组合化学基因组学以及蛋白质组学的飞速发展，越来越多的靶点和小分子库被用于药物筛选。一方面功能基因组计划能够快速的确定一些特定路径中的蛋白蛋白相互作用，另一方面各种高通量的筛选系统能够针对特定靶点进行高效快速的化合物分子库筛选。无论是酵母系统、细胞还是动物体水平，都或多或少地提供了体内的生物环境，这是其优
24、点所在。尽管这些药物高通量筛选系统在病种以及机制方面仍然有一些缺陷，但仍为传统方法提供了有效的补充，将 HTS 与传统方法相互结合能够更加高效快捷地进行药物筛选。目前最新的药物筛选除了考虑药物的药理活性以外，开始同时涉及药物的毒性和吸收、分布、代谢、排泄过程（ADME） ，从而提高筛选效率。如今药物筛选已经突破了传统的生物学范畴，而成为一个化学、生物学和工程学共同作用的过程。相信随着 HTS 方法的不断完善以及仪器设备的不断改进，高通量筛选将在新药研制过程中发挥更大的作用。参 考 文 献1 Lander E S . The New Genomics: Global Views of Biolo
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