收藏 分享(赏)

pGEM-T中文说明书.pdf

上传人:精品资料 文档编号:8764620 上传时间:2019-07-11 格式:PDF 页数:23 大小:464.85KB
下载 相关 举报
pGEM-T中文说明书.pdf_第1页
第1页 / 共23页
pGEM-T中文说明书.pdf_第2页
第2页 / 共23页
pGEM-T中文说明书.pdf_第3页
第3页 / 共23页
pGEM-T中文说明书.pdf_第4页
第4页 / 共23页
pGEM-T中文说明书.pdf_第5页
第5页 / 共23页
点击查看更多>>
资源描述

1、注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 1 页 共 23页 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体系统 原英文技术手册号码: TM042 产品 A1360, A1380, A3600 和 A3610 的操作指南。 所有技术资料均可在 网站上得到, 请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本 I. 描述 2 II. 载体图谱 3 III. 产品组分 6 IV. 采用 pGEM-T 和 pGEM-T

2、 Easy 载体和 2快速连接缓冲液进行连接 .7 A. 操作步骤 7 V. 采用 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体的连接反应产物的转化 .7 VI. 注意事项 . 8 A. PCR 产物纯度 .8 B. 平端 PCR 产物 9 C. 优化插入片段与载体的摩尔比 10 D. 有插入片段的转化子的筛选 11 E. 实验对照 .11 VII. 重组质粒 DNA 的提取 .12 VIII. pGEM-T和 pGEM-T Easy 载体单链 DNA的制备 .12 IX. 疑难解答 13 X. 参考文献 15 XI. 附录 A:载体序列及限制性酶切位点 16 A. pGEM-T 载体序列

3、16 B. pGEM-T 载体限制性酶切位点 17 C. pGEM-T Easy 载体序列 .18 D. pGEM-T Easy 载体限制性酶切位点 .19 XII. 附录 B:参考资料 21 A. 缓冲液及溶液配方 .21 B. 相关产品 .22 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 2 页 共 23页 I. 描述 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体系统可用于 PCR 产物的克隆。这两种载体是

4、通过EcoR酶切 pGEM-5Zf(+)和 pGEM-T Easy 载体,并在 3末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点 3-T 突出端可提高 PCR 产物的连接效率,因为 3-T 突出端可以防止载体的自身环化,并且为热稳定性聚合酶( 1, 2)产生 PCR 产物提供一个匹配碱基。如表 1 总结的,这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的 3端加上一个脱氧腺苷酸( 3, 4) 。pGEM-T 和 pGEM-T Easy 高拷贝数载体包含有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶启动子,其侧翼和多克隆位点区相接,多克隆位点区位于 半乳糖苷酶的 肽编码区内。 肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆

5、。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用 Promega 公司 Erase-a-Base系统(产品目录号 #E5750)产生一系列巢式缺失体。 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点,采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如 pGEM-T Easy 载体多克隆区的EcoR、 BstZ和 Not酶切位点。而 pGEM-T 载体多克隆区只有一种这样的酶切位点 BstZ。这两种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体含有丝状噬菌体 f1 复制起始子,可用于制备单链DNA (ssDN

6、A 参见第部分 )。单链 DNA 分子对应于图 1 底部一条链,图一中上图代表pGEM-T 载体,下图代表 pGEM-T Easy 载体。 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体系统包含 2快速连接缓冲液, 用于连接 PCR 产物。采用这种缓冲液进行连接,在室温孵育 1 小时即可完成。延长孵育时间可增加转化克隆菌数目。一般 4过夜连接可产生最多的转化子。 表 1. 部分热稳定性 DNA 聚合酶所产生的 PCR 产物特性的比较。 热稳定性 DNA 聚合酶 特性 Taq/ AmpliTaqTfl TthVent/ (Tli) Deep VentPfu PwoPCR 产物末端 3A 3A 3

7、A95% 平端 95% 平端 平端 平端5-3外切酶活力 有 有 有 无 无 无 无 3-5外切酶活力 无 无 无 有 有 有 有 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 3 页 共 23页 II. 载体图谱 A. pGEM-T 载体和 pGEM-T Easy 载体多克隆位点序列 pGEM-T 载体 图 1. pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体的启动子及多克隆位点区序列 。 上部序列链对应于用 T

8、7 RNA 聚合酶合成的 RNA 序列,底部序列链对应于用 SP6 RNA 聚合酶合成的 RNA 序列。 注意:用BstZ I (Cat.# R6881) 单酶切可释放插入pGEM-T 载体的 DNA 片段。 注意:用BstZ I (Cat.# R6881), EcoR I (Cat.# R6o11)或Not I (Cat.# R6431) 进行单酶切可释放插入pGEM-TEasy载体的 DNA 片段。 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail:

9、 技术手册号码: CTM042 第 4 页 共 23页 可使用 SP6 Promoter Primer (Cat.# Q5011), T7 Promoter Primer (Cat.# Q5021), pUC/M13 Forward Primer( Cat.# Q5601) , 或 pUC/M13 Reverse Primer( Cat.# Q5421)对插入的 DNA 片段进行测序。 注意: 用 BstZ I (Cat.# R6881) 单酶切可释放插入 pGEM-T载体的 DNA 片段。双酶切也可用于释放插入 pGEM-T载体的 DNA 片段。 B. pGEM-T 载体图和相关序列位点 图

10、 2. pGEM-T 载体环形图谱及相关的序列位点 pGEM-T 载体相关的序列位点 T7 RNA 聚合酶转录起始位点 1 多克隆位点区 10 113 SP6 RNA 聚合酶启动子( 17 至 3) 124 143 SP6 RNA 聚合酶转录起始位点 126 pUC/M13 反向测序引物结合位点 161 177 lacZ 起始密码子 165 lac 操纵子 185 201 内酰胺酶编码区 1322 2182 噬菌体 f1 区 2365 2820 lac 操作子序列 2821 2981, 151 380 pUC/M13 正向测序引物结合位点 2941 2957 T7 RNA 聚合酶启动子(17

11、至3) 2984 3 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 5 页 共 23页 C. pGEM-T Easy 载体图和相关序列位点 图 3. pGEM-T Easy 载体环形图谱及相关的序列位点 pGEM-T Easy 载体相关的序列位点 T7 RNA 聚合酶转录起始位点 1多克隆位点区 10 128SP6 RNA 聚合酶启动子( 17 至 3) 139 158SP6 RNA 聚合酶转录起始位点 141pU

12、C/M13 反向测序引物结合位点 176 197lacZ 起始密码子 180lac 操纵子 200 216内酰胺酶编码区 1337 2197噬菌体 f1 区 2380 2835lac 操作子序列 2836 2996, 166 395pUC/M13 正向测序引物结合位点 2956 2972T7 RNA 聚合酶启动子(17 至 3) 2999 3 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体的特殊应用 1 PCR 产物的克隆。 2采用 Erase-a-Base系统构建不定向巢式缺失体。 3单链 DNA 制备。 4重组子的蓝白斑筛选。 5 利用双向启动子进行体外转录。 (操作步骤详见 Promeg

13、a 公司 Riboprobe体外转录技术手册 TM016) 。 可使用 SP6 Promoter Primer (Cat.# Q5011), T7 Promoter Primer (Cat.# Q5021), pUC/M13 Forward Primer( Cat.# Q5601) , 或 pUC/M13 Reverse Primer( Cat.# Q5421)对插入的 DNA 片段进行测序。 注意: 用 BstZ I (Cat.# R6881) 单酶切可释放插入 pGEM-T 载体的 DNA 片段。双酶切也可用于释放插入pGEM-T 载体的 DNA 片段。 注意:本中文操作手册仅供实验参考,

14、在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 6 页 共 23页 III产品组成 产品 包装 目录号 pGEM-T 载体系统 20 个反应 A3600 包括: 1.2g pGEM-T 载体 (50ng/l) 12l 插入 DNA 对照( 4ng/l) 100 U T4DNA 连接酶 200l T4DNA 连接酶的 2快速连接缓冲液 1 操作手册 产品 包装 目录号 pGEM-T 载体系统 20 个反应 A3610 包括: 1.2g pGEM-T 载

15、体 (50ng/l) 12l 插入 DNA 对照( 4ng/l) 100 U T4DNA 连接酶 200l T4DNA 连接酶的 2快速连接缓冲液 1.2ml JM109 高效率感受态细胞( 6 200l) 1 操作手册 产品 包装 目录号 pGEM-T Easy 载体系统 20 个反应 A1360 包括: 1.2g pGEM-T Easy 载体 (50ng/l) 12l 插入 DNA 对照( 4ng/l) 100 U T4DNA 连接酶 200l T4DNA 连接酶的 2快速连接缓冲液 1 操作手册 产品 包装 目录号 pGEM-T Easy 载体系统 20 个反应 A1380 包括: 1.

16、2g pGEM-T Easy 载体 (50ng/l) 12l 插入 DNA 对照( 4ng/l) 100 U T4DNA 连接酶 200l T4DNA 连接酶的 2快速连接缓冲液 1.2ml JM109 高效率感受态细胞( 6 200l) 1 操作手册 贮存条件: 产品 A1360 和 A1380 中的感受态细胞保存在 70。所有其它组份可以保存在 20或 70。 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 7

17、页 共 23页 IV 采用 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体以及 2快速连接缓冲液进行连接反应的步骤 1 短暂离心 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体及 DNA 插入对照管,使内容物汇集到管底。 2 按以下方法建立连接反应。注意使用低 DNA 结合力的 0.5ml 离心管(如VWR 目录号 20170 310) 3 每次使用快速连接缓冲液时要充分混匀。 标准反应 阳性对照 背景对照T4DNA 连接酶的 2快速连接缓冲液 5l 5l 5l pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体 ( 50ng) 1l 1l 1l PCR 产物 Xl* 插入 DNA 对照 2l T

18、4DNA 连接酶( 3 Weiss 单位 /l) 1l 1l 1l 补加去离子水至终体积 10l 10l 10l * PCR 产物 :载体的摩尔比可能需要进行优化(见章节 VI.C) 4 用移液器吹打连接反应使之混匀后,室温孵育 1 小时。 5 如果需要得到最大数目的转化菌落,可选择 4孵育过夜。 注意: 1 在使用 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体连接时只能使用本系统提供的Promega 公司 T4 DNA 连接酶。其他商用的 T4 DNA 连接酶可能具有外切酶活力,造成载体的末端胸腺嘧啶被除去。 2 快速连接缓冲液含有 ATP,在温度波动时 ATP 易降解。可将缓冲液分装成一

19、次用量的小管,这样可避免反复冻融及经常的温度变化。 3 在每次使用快速连接缓冲液时一定要用混悬器混匀。 4 长孵育时间可增加转化子的数目, 一般 4孵育过夜可得到更多的转化子。 V pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体连接反应产物的转化步骤 一定要使用高效率的感受态细胞( 1 108cfu/g DNA)进行转化,因为采用单碱基突出端进行连接不是很有效,采用转化效率高的感受态细胞 1 108cfu/g DNA(或更高)可得到合理的克隆菌数目(参见章节 VI. E) 。 我们建议使用 JM109 高效感受态细胞(产品目录号: L2001) , pGEM-T 和pGEM-T Easy 载体

20、系统提供这种感受态细胞。也可使用其他宿主菌,但是它们应该适合用蓝白斑及氨苄进行筛选。 在使用 JM109 制备感受态细胞前, JM109 应保存在含加维生素 B1 的 M9 基本培养基中,这有助于 F因子的选择, F因子带有 proAB 基因,这和脯氨酸营养缺陷型宿主菌( proAB 基因缺失)是互补的,携带的 lacIqZ M15 对于蓝白斑筛选是必需的。如果你不采用 Promega 公司 JM109 高效率感受态细胞,应按照后面的转化步骤进行操作。在 LB/氨苄 /IPTG/X-Gal 平板筛选转化子(参见章节 XI. A) ,为得到理想的结果,最好不要使用放置超过 1 个月的平板。 JM

21、109 的基因型是: recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rK,mK+), relA1, supE44, ( lac-proAB), F, traD36, proAB, laclqZ M15 (5). 制备感受态细胞所用的 JM109应保存在含加维生素 B1 的 M9基本培养基中 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 8 页 共 23页 在第 3 步,避免反复吹打, 因感受

22、态细胞特别脆弱。 操作者需准备的材料(溶液配制参见章节 XII. A) z LB 平板(含有氨苄 /IPTG/X-Gal) z SOC 培养基 1 每个连接反应准备 2 个 LB/氨苄 /IPTG/X-Gal 平板, 附加 2 个平板测定转化效率(见章节 VI.E) ,涂板前将平板平衡至室温(步骤 10) 。 2 离心使连接反应内容物汇集到管底,取 2 l 连接反应产物加到置于冰上的1.5ml 离心管中(见注意事项 1) ,向另一置于冰上的 1.5ml 离心管加入 0.1ng未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。 (见章节 VI.E) 3 将冻存的 JM109 高效率感受态细胞从 70冰箱中

23、取出, 放置在冰浴直至融化(大概 5 分钟) ,轻轻振动离心管使之混匀。 4 向步骤 2 准备的每个转化管中加入 50 l 感受态细胞。 (加入 100 l 细胞进行转化效率的测定) 5 轻轻振动小管混匀,冰浴 20 分钟。 6 在精确的 42水浴中热击 45 50 秒(不要振动) 。 7 迅速将管子移到冰浴中,使细胞冷却 2 分钟。 8 每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的 950 l SOC 培养基, 而转化未酶切质粒的细胞加入 900 l SOC 培养基。 (可加入 LB 培养基,但得到的克隆菌数目可能会降低。 ) 9 在 37振荡培养( 150rpm) 1.5 小时。 10 将每个转

24、化培养基 100 l 涂到两个 LB/氨苄 /IPTG/X-Gal 平板上。对于转化对照,建议涂板时用 SOC 培养基 1: 10 稀释。如果期望得到更高的克隆数目,可将细胞用 1000 x g 离心 10 分钟沉淀,然后用 200 l SOC 培养基重悬后,各取 100 l 涂 2 块板。 11 将平板于 37过夜培养( 16 24 小时) 。我们的实验经验是:使用 1108cfu/g DNA 的感受态细胞,每个平板涂布 100 l,大约可得到 100 个克隆。长时间孵育或将平板 37过夜培养后贮存在 4,有助于蓝白斑筛选。白色克隆菌一般包括插入子,然而,蓝色克隆菌也有可能包括插入子,更多信

25、息请参看章节 VI.D。 注意: 1. 实验证明使用大的( 17 100mm)聚丙烯管(比如 Facon 公司产品,目录号: 2059) ,可增加转化效率。实验时避免使用可结合 DNA 的管子,因为其大大降低克隆菌数目。 2. 包含 -半乳糖苷酶活性的克隆菌相对于无该酶活性的菌而言,生长比较慢。过夜培养后,一般蓝斑比白斑小,大约 1 m 直径大小。 VI注意事项 A. PCR 产物的纯度 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。用于连接反应的 PCR 产物可用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(d)(Cat.# A9281)进行胶纯化或直接

26、进行 PCR 产物的纯化。 应尽量减少暴露在短波紫外灯的时间以避免嘧啶二聚体的形成。如果电泳检测 PCR 产物条带弥散,或出现非特异条带,则需要切下目的条带,并用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 纯化 DNA。即使 PCR 产物电泳检测只有预期大小的明显条带,也应使用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 对目的条带进行凝胶纯化或 PCR 产物直接纯化以除去引物二聚体。不经纯化的 PCR 产物在某些条件下可直接用于连接,但由于引物二聚体和 PCR 产物中其它物质的影响,造成含有插入片段的阳性克隆数减少,因而需要筛

27、选很多克隆方可得到含有目的 PCR产物的阳性克隆。 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 9 页 共 23页 B. 平端 PCR 产物 具有校正活性的热稳定性 DNA 聚合酶如 Pfu DNA 聚合酶 (产品目录号: M7741),Pwo DNA 聚合酶, Tli DNA 聚合酶 (目录号 M7101) 在进行 PCR 扩增时产生平端 PCR产物。 这种平端 PCR 产物可以通过加 A 尾程序后 (图 4)

28、 , 连接到 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体中( 6) 。采用这种方法连接,只有一个片段插入,而平端连接克隆可能产生多个插入。另外采用 T 载体克隆不需要对载体去磷酸化,载体自连的背景很低。 Pfu 和 Tli DNA 聚合酶产生的 PCR 产物经过加尾处理,并以理想载体:插入片段比例进行连接,可得到 55 95重组子(表 2) 。值得注意的是, PCR 产物有必要采用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(d)(Cat.# A9281)进行 PCR 产物直接纯化或凝胶纯化。若 PCR 产物不进行纯化, Pfu、 Pwo 和 Tli DNA

29、 聚合酶的校正活性在进行加尾反应或连接反应时,可降解 PCR 片段的 3-A 或除去加尾反应的载体的 3-T突出端。 为了提高克隆效率,应根据纯化 PCR 产物的摩尔浓度调整加尾反应中的 DNA 量和连接需要的体积。当 PCR 产物片段小或扩增反应良好,产物的摩尔浓度高,加尾或连接反应需要的体积很小。相反,如果 PCR 片段比较大或扩增不好,产物的摩尔浓度低,则需要较大的体积。我们已成功地用 Taq DNA 聚合酶 对 1-7l 纯化的平端 PCR片段进行加尾反应,并优化插入片段 :载体的连接比例,参见章节 IV.C 详细讨论了插入片段 :载体比例的优化。转化后采用蓝白斑筛选重组子,结果 70

30、 100的重组子含有PCR 扩增的 DNA 片段,而 PCR 片段没有加尾的对照反应,只有很少的重组子。对照实验结果表明大多数 pGEM-T Easy 载体含有 3-T, 并且 Taq DNA 聚合酶可成功对大多数 PCR 片段加上 3-A。 表 2. 用于不同 DNA 聚合酶的加 A 尾程序的比较 重组子124连接 1 小时 (标准方法) 4连接 16 小时 (可供选择的方法) 聚合酶 542bp 1.8kb 542bp 1.8kb Pfu DNA 聚合酶 65-84%231-55%381-95%250-75%3Tli DNA 聚合酶 68-77%437-65%585-93%460-81%5

31、将 Pfu 和 Tli DNA 聚合酶产生的 PCR 产物加 A 尾后和 pGEM-T Easy 载体进行连接, 连接条件是 24连接 1 小时或 4连接 16 小时。将 2l 连接反应物转化 JM109 感受态细胞,涂布在 LB/氨苄/IPTG/X-gal 平板上。 1 重组子 =白色克隆菌数 /白色和蓝色克隆菌数 100。 PCR 产物加 A 尾前经过 WizardPCR Preps DNA 纯化系统(f)纯化。 2 检测的插入片段 :载体连接比例为 5:1, 3:1, 1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 1-2l。 3检测的插入片段 :载体连接比例为 3:1, 2:1

32、, 1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 3-7l。 4检测的插入片段 :载体连接比例为 3:1, 2:1, 1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 1-2l。 5检测的插入片段 :载体连接比例为 2:1, 1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 4-7l。 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 10 页 共 23页 注意: 对同样的插入片段, 若使用插入片

33、段 :载体摩尔比为 1:1,需要0.5kb 的插入片段 8.3ng。 由具有校正活性的 DNA 聚合酶(如 Pfu DNA 聚合酶)产生的 PCR 扩增片段的纯化产物 1-7l 加入 1l Taq DNA 聚合酶 10反应缓冲液(含 MgCl2) 加入 dATP 至终浓度 0.2mM。 加入 5 单位的 Taq DNA 聚合酶 加去离子水至终反应体积为 10l 70孵育 15-30 分钟 采用 1-2l 用于 Promega 公司 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体连接反应 图 4. 用于 T-载体克隆的平端 PCR 产物经过 Wizard SV Gel and PCR Clean

34、-Up System (Cat.# A9281) 纯化后加 A 尾实验步骤。 C优化插入片段和载体的摩尔比 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体系统优化的插入 DNA 对照片段和载体的摩尔比为 1:1,采 用 8:1 到 1:8 的连接比例也可成功进行连接。如果你的 PCR 产物开始的连接不理想,则有必要优化连接比例。一般开始采用 3:1 到 1:3 的连接比例。PCR 产物的浓度可通过凝胶电泳上的 DNA 分子量标准进行估计或采用荧光定量。pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体大概 3kb 大小, 系统提供的载体浓度为 50ng/l。计算连接反应中需要的 PCR 产物的量可

35、采用以下公式。 加入载体的量( ng)插入片段大小( kb)载体大小( kb) 插入片段和载体的摩尔比 =插入片段的量( ng) 根据推荐的不同插入片段 :载体比例加入足够的 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体进行连接,并进行对照反应。 举例说明插入片段和载体比例计算: 假如插入片段和载体的连接比例为 3:1,如连接反应中加入 3kb 载体 50ng,问 0.5kb PCR 产物需加入多少? 50ng载体 0.5kb插入片段 3.0kb载体 3/1 =25ng 插入片段 注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promeg

36、a 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 11 页 共 23页 D筛选含插入片段的转化子 插入片段成功克隆到 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体中,可阻断 半乳糖苷酶的编码序列, 因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。 然而连接到 pGEM-T和 pGEM-T Easy 载体的 PCR 产物的特点对转化后蓝白斑克隆菌的比例影响很大。 大多数情况下含有 PCR 产物的克隆菌为白色, 如果 PCR 片段和 LacZ 基因在同一读码框,则重组克隆菌可能为蓝色。这种 DNA 片段碱基数是 3 的整数倍(含 3

37、-A) ,并且读码框无终止密码子。据文献报道,在同一读码框内插入长达 2kb 的 DNA 片断,重组克隆菌仍可能为蓝色。 即使 PCR 产物不是 3 的整数倍大小,由于扩增反应可引入突变(缺失或点突变) ,也可造成 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体和片段连接转化后,重组克隆菌为蓝色。 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体系统的对照 DNA 为 542bp,来源于 Promega公司 pGEM-luc( b,个 g)DNA (Cat.#E1541),这个 DNA 序列被引入突变,在 6 个读码框中含有多个终止密码子, 从而确保对照反应产生的蓝色克隆菌的背景数很低。 由此可

38、见,插入 DNA 对照的结果不能代表你的 PCR 产物的连接结果。 E. 实验对照 Promega 公司强烈推荐使用以下对照操作,这些对正确评价 pGEM-T 和pGEM-T Easy 载体系统是必要的。 阳性对照 采用插入 DNA 对照建立连接反应(章节 IV) ,并按照第部分介绍的方法进行转化。 这种对照反应可确定是否能有效连接。 一般当感受态细胞转化效率为 1 108cfu/g DNA,可观察到大约 100 个菌落,其中 10 40菌落为蓝色,超过 60为白色。插入的 DNA 对照是经过专门设计的,其插入可产生白斑,然而其它的 DNA 片段插入可能不产生白斑(见章节 VI.D) 。阳性对

39、照连接产生的蓝斑背景来自无 T 尾及不完全消化的 pGEM-T 和 pGEM-T Easy 载体。这些蓝斑也可看作一个内在的转化对照,如果转化结果没有任何克隆菌,表明是转化本身有问题。如果只得到蓝斑,没有白斑产生,则说明连接反应存在问题。如果阳性对照 28)可增加背景,重组克隆菌减少。 快速连接缓冲液稀释不当。 提供的 T4连接酶缓冲液为二倍浓度, 10 l 反应体积加 5 l T4连接酶缓冲液。连接孵育时间不够长。 连接过夜可得到理想结果。 PCR 产物连接时白色菌落数很少或根本没有。 PCR 产物中含有抑制连接的成分,导致连接失败。 将 PCR 产物和连接反应对照混合,观察是否存在抑制效应

40、。如怀疑有抑制成分存在,应重新纯化 PCR 产物。 PCR 产物不能连接,因为其没有 3-A 突出端。 如表 1 所述,并非所有 DNA 聚合酶都产生 3-A 突出端( 3, 4) 。平端 PCR产物可采用适当的聚合酶及 dATP 进行加尾反应产生 3-A 突出端。 由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体, PCR 产物不能连接。 凝胶纯化的 DNA 常出现这样的问题,没有任何办法可以解决, DNA 需重新制备。注意暴露在紫外灯下的时间应尽量缩短。在凝胶和紫外灯之间使用玻璃板可降低紫外灯的过度照射。如果可能,尽量使用长波长紫外光源观察 PCR 产物。 PCR 产物已经插入, 但未破坏 lacZ 基因

41、。 如果和背景对照相比有很多蓝色菌落,这些蓝色菌落可能含有插入片段。蓝色和白色菌落均可用于筛选(参见章节VI.C) 插入片段: 载体连接比例不理想。 凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性及浓度,优化插入片段:载体比例(参见章节VI.C) 。 连接的 PCR 片段中可能有引物二聚体。 引物二聚体可连接到 pGEM-T 或pGEM-T Easy 载体中,因为它们很小,所以酶切消化后电泳检测看不到带, 看起来载体中没有插入。和背景对照相比,连接产生较多蓝色克隆。 PCR 产物需要重新凝胶纯化。 PCR 反应扩增的多种产物克隆到 pGEM-T 或pGEM-T Easy 载体中。凝胶纯化目的条带。 DNA

42、 重排。 检测大量克隆观察重排是否是随机的。 如果是随机重排,通过筛选可得到有目的DNA 片段的克隆菌,而如果所有克隆是一种重排方式, 则需要使用修补缺陷的菌株保护插入片段,减少重排事件的发生。注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京办事处联系, TEL: 010-68498287; E-mail: 技术手册号码: CTM042 第 15 页 共 23页 氨苄失活,因而氨苄敏感菌可生长。 检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用。 菌株(如 JM109)丧失 F因子。 检测背景对照,如果菌落不是蓝色的,则可能是

43、宿主菌细胞丢失 F因子(假设lacIqZM15 位于宿主菌的 F因子上,并使用正常平板) 。用于 T-载体系统的感受态细胞一定要正确制备。 (参看章节) 。PCR 连接反应只产生白色克隆(没有蓝色克隆) 。 平板不适合蓝白斑筛选。 检测背景对照,如果克隆菌不是蓝色的,检查平板是否含有氨苄 /IPTG/X-Gal 以及是否新鲜。如平板有问题,重新制备新鲜平板。 PCR 片段很多没有 A 尾。 将 PCR 产物纯化后进行加尾反应( 9,10) 。样品纯化后进行连接反应。 插入片段:载体比例不理想。 凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性及产量,优化插入片段:载体比例(参见章节 VI.C) 。 含有目的

44、 PCR产物的克隆菌数不够。 多个 PCR 产物被克隆进pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体 凝胶纯化目的 PCR 产物。 X 参考文献 1. Mezei, L.M. and Storts, D.R. (1994) Purification of PCR products. In: PCR Technology: Current Innovations, Griffin, H.G. and Griffin, A.M., eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 21. 2. Robles, J. and Doers, M. (1994) pGEM-T Vect

45、or Systems troubleshooting guide. Promega Notes 45, 19. 3. Clark, J.M. (1988) Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 16, 9677. 4. Newton, C.R. and Graham, A. (1994) In: PCR, BIOSScientific Publishers, Ltd., Oxford, UK, 13. 5. Knoche, K. and Kephart,

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 企业管理 > 管理学资料

本站链接:文库   一言   我酷   合作


客服QQ:2549714901微博号:道客多多官方知乎号:道客多多

经营许可证编号: 粤ICP备2021046453号世界地图

道客多多©版权所有2020-2025营业执照举报