1、Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 荧光定量PCR 实验原理及数据分析内容概要 荧光定量PCR 的原理 荧光定量PCR 的标记方法 荧光定量PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 2 荧光定量PCR 原理 定义 实时定量PCR 技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 ，通过Ct 值和标准曲线的关系对 起始模板 进行定量分析 与常规 PCR 技术比较： 对PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析， 无法对起始模板准确定量 ，无法对扩增反应实时检测 3荧光定量PCR 原理 常用名词概念
2、 扩增曲线 荧光阈值 Ct 值 4荧光定量PCR 原理 扩增曲线 5 Cycle （循环数） Rn（荧光强度） Baseline Lg liner phase 平台期 荧光基团 荧光检测元件荧光定量PCR 原理 荧光阈值 6 Cycle （循环数） Rn（荧光强度） Baseline Lg liner phase 平台期 前15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline ） 荧光阈值的缺省设置是3 15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍 手动设置: 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号: 荧光信号超过阈值 Threshold荧光定量PCR 原理
3、Ct值 7 Cycle （循环数） Rn（荧光强度） Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Ct value 荧光定量PCR 原理 Ct值的重现性 8 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct 值的特点： 相同模板进行96 次扩增，终点处产物量不恒定； Ct 值极具重现性荧光定量PCR 原理 Ct值定量的数学原理 9 理想的PCR 反应 X n X 0 2 n * X n ：第n 次循环后扩增产物数量 X 0 ：起始模板数量 n ：扩增循环数荧光定量PCR 原理 Ct值定量的数学原理 10 非理想的PCR 反应 X n X 0
4、（1 En ） n * X n ：第n 次循环后扩增产物数量 X 0 ：起始模板数量 n ：扩增循环数 En ：扩增效率荧光定量PCR 原理 Ct值定量的数学原理 11 在扩增产物达到荧光阈值时 X Ct X 0 * （1 En ） Ct M （1 ） 整理方程式（2 ）： 方程式（1 ）两边同取对数得： X Ct ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M Log 2 MLog 2 X 0 * （1 En ） Ct （2 ） Log 2 X 0 = Log 2 M-Ct Log 2 （1 En ）荧光定量PCR 原理 Ct值与起始模板量的关系 12 Cyc
5、le number Ck 10 4 Ck 10 2 Sample Lg of DNA concentration 模板DNA 量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct 值越小。 Log 模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。荧光定量PCR 原理 荧光定量反应性的确认 13 线性关系、扩增效率确认 相关系数（R 2 ）：大于0.98 标准曲线斜率：-3 -3.5 PCR 扩增效率（E）：0.9-1.2 检测灵敏度确认 35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR 检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增 No template control 确认 35 Cycles 内无引物二聚
6、体产生内容概要 荧光定量PCR 的原理 荧光定量PCR 的标记方法 荧光定量PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 14 常用荧光定量标记方法 15 非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan ProbeSYBR Green I 染料法 原理 16 SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I SYBR Green ISYBR Green I 染料法 作用机理 17 热变性 热变性 引物退火 引物退火 延伸反应 延伸反应SYBR Green I 染料法
7、 问题点与关键点 18 问题点： SYBR Green I 与双链DNA 进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！SYBR Green I 染料法 融解曲线 19 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱SYBR Green I 染料法 融解曲线 20 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光： 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光： 定量不准确SYBR Green I 染料法 优缺点 21 使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优
8、势 优点 无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低 缺点Taqman 探针法 原理 22 5 端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM 、VIC 等 3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R 发射的荧光能量被Q 基团吸收 ，无荧光， R 与Q 分开，发荧光 Taq 酶有 5 3 外切核酸酶活性，可水解探针Taqman 探针法 工作机理 23 热变性 热变性 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 延伸反应 延伸反应 探针 探针 报告基团 报告基团 淬灭基团 淬灭基团 探针 探针 DNA DNA 聚合酶 聚合酶 引物 引
9、物 R R R R R R R RTaqman 探针法 PCR体系的建立 1. 引物、探针的设计： 探针Tm 为68-70 , 30 bp, 5 不能有G, G 可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针, 扩增片段400 bp, 引物Tm 为59-60 2. 反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60 ，30-60S （Taq 酶5 3 外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3. 优化引物和探针浓度：获得最小Ct 值，最大信号/ 背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4. 其他与常规PCR相同 24Taqman 探针法 优缺点 25
10、高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量 优点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺点实时荧光定量PCR 分类 分子信标 26 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素淬灭剂实时荧光定量PCR 分类 分子信标 27 FRET实时荧光定量PCR 分类 分子信标 28 高特异性：对目标序列 检测SNP 最 灵 敏的试剂之一 荧光背景低 优点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺点几种荧光定量PCR方法的应用比较 29 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求
11、高 易出现非特异性带 适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究 TaqMan 特异性高 重复性好 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 分子信标 高特异性 荧光 背景低 只适合特定目标 设计困难 价格高 特定基因分析 SNP 分析荧光定量PCR技术的主要应用 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs ）分析等 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO 定量检测等 相对定量研究：mRNA 表达量分析，siRNA 效果确认，差异显示结果验证等 30内容概要 荧光定量PCR 的原理 荧光定量PCR
12、 的标记方法 荧光定量PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 31 荧光定量PCR的解析方法 绝对定量解析方法 相对定量解析方法 32 绝对定量的定义 33 Sample 2 5 Log （ 起 始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线, 即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量绝对定量分析几要素 34 一个 目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。 一组 标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR 产物、基因组DNA 等。 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以
13、确保统计显著性。 标记方法的选择 SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。 实验结果显示 扩增曲线；标准曲线；融解曲线( 探针法不需要)。绝对定量质粒标准品的制备 35 PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 目的基因 目的基因 基因组DNA 质粒提取，OD 值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 36 倍比梯度稀释方法： 1v 原液(标准品i) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii 1v 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii 1v 标准品iii +9v 稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv +9v 稀释缓冲
14、液，得标准品v 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul ）=OD 260 40 稀释倍数 样本分子量= 碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul ）= 待测样本浓度/ 样本分子量6 10 14绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 37 方法： 从血液中提取病毒DNA ，以TaqMan 探针法进行荧光定量检测 标准品： 质粒标准品浓度为10 6 、10 5 、10 4 、 10 3 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤： 提取HBV DNA ； 设计特异引物； 设计TaqMan 探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA 的精确copy 数。绝
15、对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 38 Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5 10 3 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5 10 4 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5 10 5 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5 10 6 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 39 扩增效率（E ）计算 E =10 -1/ 斜率-1 =10
16、 -1/-3.29 -1 =2.01 -1 =1.01 标准曲线制作： 利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R 2 = 0.9978 15 20 25 30 510 3 5104 5 105 5 106 Copies Ct 相关系数（ 相关系数（R R 2 2 ）：大于 ）：大于0.98 0.98 ，越接近 ，越接近1 1 ，结果可信度越高。 ，结果可信度越高。 扩增效率（ 扩增效率（E E ）： ）：0.8 0.8- -1.2, 1.2, 越接近 越接近1 1 ，越理想。 ，越理想。绝对定量实验例 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 40 未知样品拷贝
17、数的计算 将Ct 值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 Quantity Unknown =10 6.03 =1,071,519 copies X= 20.5-40.33 -3.29 =6.03荧光定量PCR的解析方法 绝对定量解析方法 相对定量解析方法 41 相对定量的必要性 42 Sample B Sample B Sample A Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA 提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 实际目的基因表达量分析 实际目的基因表达量分析相对定量分析方法 43 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ 关注点：基因
18、的相对表达量，而不是基因的绝对量！相对定量分析几要素 44 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性 标记方法的选择SYBR Green 法或探针法均可 实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要） 一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析 管家基因筛选 45 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因， 如：GAPDH、Actin、18S rRNA 等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 0 0 1 1 2 2 3 3
19、 4 4 5 5 6 6 Sample1 Sample1 Sample2 Sample2 Sample3 Sample3 Sample4 Sample4 实验组 实验组 实验值 实验值 - -Actin Actin GAPDH GAPDH - -2 2- -microglobulin microglobulin HPRT HPRT 相对定量分析 两种常用的分析方法 46 双标准曲线法 2 -Ct 法相对定量分析 双标曲线法 47 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 公式： 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定
20、量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值相对定量分析 双标曲线法 48 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 检测样品 管家基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 实验数据相对定量分析 2 Ct 法 49 公式： F = 2 优点： 无需作标准曲线 缺点： 假定扩增效率为 100 %
21、 ； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。 应用： 基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct 值 待测组内参基因 平均Ct 值 对照组目的基因 平均Ct 值 对照组内参基因 平均Ct 值 相对定量分析 2 Ct 法 50 实验数据： 2 - Ct 法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100% Ct （处理前）18 17 1 Ct （处理后）16 17.4= 1.4 Ct= Ct （处理后）Ct （处理前）1.4 1 2.4 比率 （处理 后/ 处理 前）2 Ct 2 （ 2.4） 5.3 所以Jun 基因在处理后表达水
22、平是处理前的5.3 倍 修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有 相同的扩增效率，但扩增效率不等于2 ，那么2 Ct 可以修正为：E Ct ，例如扩增效率为1.95 ，那么计算公式可修正为1.95 Ct Sample Jun (Mean Ct) GAPDH (Mean Ct) E 处理前 18 17 1.95 处理后 16 17.4 1.95内容概要 荧光定量PCR 的原理 荧光定量PCR 的标记方法 荧光定量PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 51 荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 52 样品制备 定量体系配备 引物设计 反应条件优
23、化 浓度确定 技能要求 环境要求 误差控制 数据分析 仪器介绍 RT 上机 反应体系优化 试剂选择 分析方法荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 53 样品制备 环境要求 定量体系配备 数据分析 RT 上机 浓度确定 无RNase 环境 使用无RNase 耗材 专用RNase-free 工具 纯度高、完整性好的 纯度高、完整性好的RNA RNA 分光光度计检测 电泳检测荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 54 样品制备 试剂选择 定量体系配备 数据分析 RT 上机 反应体系优化 AMV M-MLV 高效，全长的 高效，全长的cDNA cDNA 下游反应数确
24、定反转录体积 引物的选择荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 55 样品制备 误差控制 定量体系配备 数据分析 RT 上机 浓度确定 引物设计 环境要求 使用mix 降低系统误差 设置重复（3 次） 设置空白和阴性对照 均一的反应液和模板混合物 均一的反应液和模板混合物 制作标准曲线 设定浓度区间 GC ：5060 Tm ：50 65 单个碱基重复4 个 无二级结构 扩增长度：100 200bp 核酸制备区 反应液制备区荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 56 样品制备 定量体系配备 数据分析 RT 上机 反应体系优化 反应条件优化 标准品 待测样本 阳性
25、对照 阴性对照 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 反应体积5ul，推荐20 50ul 引物浓度优化，模板量优化 Mg2 调节，酶活调节 扩增效率：90 110 重复性：std 0.2 标准曲线：R 0.99或R 2 0.98荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 57 样品制备 定量体系配备 数据分析 RT 上机 自配 购买即用型 RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer Linegene series 分装控制 内参控制 机器校正控制 可
26、靠，准确的数据 可靠，准确的数据 技能要求 误差控制 仪器介绍 试剂选择荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 58 样品制备 定量体系配备 数据分析 RT 上机 仪器介绍 分析方法 平滑曲线，重复性好，灵敏度高 平滑曲线，重复性好，灵敏度高 相对定量：2 Ct 法 绝对定量：标准曲线法荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 59 ABI 7500 ABI StepOne Roche Lightcycler 1.5 Roche Lightcycler 480 Corbett Rotor-gene3000 Corbett Rotor-gene6000 荧光定量(SYBR Green) 实验流程及注意事项 60 Bio-rad MiniOpticon 杭州博日 LINE-GENE FQD-66A Bio-rad iQ5 Stratagene Stratagene Mx3005P Mx3005P TM TM Cepheid SmartCycler内容概要 荧光定量PCR 的原理 荧光定量PCR 的标记方法 荧光定量PCR 解析方法 荧光定量实验流程及注意事项 生工荧光定量产品选择指南 61 Thanks ！ 62
