1、1糖化酶固定化的研究进展姓 名: 王 永 明 院 系: 食品化工系 专 业： 食品生物技术 班 级： 12 食品生物技术 学 号： 2012030119 日 期： 2013 年 12 月日 2糖化酶固定化的研究进展摘要：主要从包埋法、共价结合法、吸附法和交联法四个方面介绍了固定化糖化酶的研究进展情况，并提及其他固定化方法，论述了固定化糖化酶的稳定性的研究进展，指出了糖化酶的研究方向和发展趋势。以及糖化酶的研究趋势。 关键词：白酒生产 固定化 固定化方法 稳定性研究糖化酶是酶制剂工业中应用最广泛，用量传统白酒生产所使用的曲中微生物是依靠最大的一种淀粉酶，其主要作用是分解淀粉，产自然界带入的，未经
2、筛选，其糖化力较低，生葡萄糖。我国传统白酒的生产大多使用淀粉酸耐热性能都较差，这在客观上减弱了对杂雀质原料，一般以曲为糖化剂，成本高，出酒率危害的自卫能力。随着白酒工业的发展，利用糖化酶代替部上的陈曲，以减少曲本身的杂菌含量，却又阶分曲，以提高出酒率，降低生产成本，已被众低了糖化力;传统白酒的制曲温度很高，如雀多白酒企业普遍采用，尤其近几年活性干酵母香型曲顶温高达 65 C，有益微生物在高温下大的出现，更使糖化酶在白酒中的用量飞速增长，量死亡，必然导致糖化力的急剧下降，所以传即使一向在工艺技术上十分谨慎的名酒厂也都统白酒的用曲量很大，浓香型酒用曲量为原料在生产中使用了糖化酶，或者在丢糟中应用了
3、的 25%左右，酱香型酒高达 80%左右。然而，由于我国白酒企业的技术水平但是，用曲量也不能无限制地增加，用胜参差不齐，各种白酒的生产工艺千差万别，因量增加后，曲中杂菌数量也相应加大，不仅刘而糖化酶在我国传统白酒生产中的应用就很难出酒无益，而且对酒质有影响，行业有“曲大有一个科学规范的标准，有些企业应用时比较酒苦”之说。所以，出于对传统白酒的香味、冈盲目，在使用的方法、用量、目的上显得很混格、质量考虑，在不彻底改变传统工艺的情次乱，最终的使用效果自然不够理想。为了真正下，利用糖化酶改善传统白酒的糖化发酵状玩发挥科学技术第一生产力的作用，让糖化酶这提高出酒率是可行的，也是必要的。糖化酶在传统白酒
4、中的应用效果 糖化酶的应用，使粮酷入窖后发酵升温快，升温幅度大，提高原料的出酒率，缩短发酵周期，降低生产成本，这已成为无可争辩的事实，主要问题是所产酒的质量，较之对照组总酸总醋低，所含香味成分少口感单薄，欠协调，后味短等。这可能是由于糖化酶的添加，加速和改变了发酵中的某些代谢途径，因而可能影响了香味物质的形成，如醋量略有减少，高级醇量增加等。但这些不应该成为糖化酶在传统白酒中应用的障碍，因为，糖化酶作为一个现代生物制品，其自身的长处或者说特点是高效专一的催化作用，对酒的质量稍有影响，很可能责任不在糖化酶，而在于我们尚未摸索到一条最佳工艺3路线。若减曲过多，影响酒质和风格就不足为奇了。在目前情况
5、下我们完全可以采用一些其它质量措施与之相配套，以弥补质量不足。糖化酶是葡萄糖淀粉酶(glucoamylase EC 3121113)的俗称，是由微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶，它作为淀粉原料糖化剂被广泛应用于食品和发酵工业中。随着生物技术的迅猛发展，酶法生产葡萄糖及葡萄糖异构化的大规模工业化生产，使糖化酶的需要量越来越大，其产量最大，约占酶制剂总产量的 1/ 2 以上。但糖化酶易于失活，具有稳定性差、难与底物分离等缺点。酶的固定化是 20 世纪 60 年代发展起来的，固定化酶稳定性强、可反复使用，适于生产的连续化和自动化。近几十年来世界各国科学家对糖化酶的固定化作了大量的研究，展示了很好的
6、工业应用前景。本文论述了糖化酶的固定化方法，固定化糖化酶的稳定性的研究进展，指出了糖化酶的研究方向和发展趋势，以及糖化酶的研究趋势。一、糖化酶的固定化方法用物理和化学的方法将酶束缚或限制于一定的空间内使之仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术称为酶的固定化。(一)包埋法包埋法是指将糖化酶包埋在凝胶的微小空格内或半透膜的微型胶囊中，载体的孔径不能大于酶分子，以免糖化酶渗出。常用的载体有聚丙烯酰胺、三醋酸纤维、聚乙烯醇等，其中前两者效果最好，而且被广泛使用。陈雄 1采用明胶和海藻酸钠聚合，并加入戊二醛作交联剂，包埋制备固定化糖化酶。结果表明：固定化酶米氏常数 Km为 12. 3 g
7、 /L，游离酶米氏常数 Km 为 7.5 g /L，固定化酶最适温度 70，游离酶为 60 ，同时固定化酶明显提高了游离酶的耐热性、储藏稳定性和操作稳定性。固定化酶重复使用 10 次活性未见下降。重庆大学董昭等 2采用海藻酸铝包埋固定化糖化酶的方法，对固定化酶和游离酶的特性进行了比较。结果表明：固定化酶米氏常数 Km 为13.72 mg/ml，最适温度为 65 ，半衰期为 100.7 d，固定化糖化酶的活力为 3455 u /g，其活力回收率 61 .8%。重庆大学徐云兰 3以飘珠为吸附剂，以海藻酸钙凝胶为包埋剂成功制备了固定化糖化酶，其活力回收率达 67. 9%。其保存稳定性增强，对热和酸碱
8、的稳定性明显增强。与游离酶相比，其最适温度和 pH 均基本不变。(二)共价结合法共价结合法是将酶分子的某些侧链基团以共价键形式与不溶性载体结合，因此酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复使用性，是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法的最大缺陷是常引起酶蛋白高级结构变化，破坏酶的活性中心。常用载体包括天然高分子（纤维素、淀粉、胶原及衍生物等） 、 合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等） 。从 60 年代中期开始，对无机载体多孔玻璃固定糖化酶研究就非常活跃。美国学者最早使用多孔玻璃4氨基硅烷衍生物和多孔陶瓷为载体固定糖化酶。纤维素及其衍生物为载体固定
9、化糖化酶是从 70 年代开始的，其重点是如何活化载体，使其能和糖化酶偶联。例如，中国科学院曲红波等 4报道了一种多孔醋酸纤维素球形固定化酶载体的制备技术，以 NaIO4 氧化法活化，固定糖化酶，测定了固定化糖化酶的催化反应特性，并与游离酶作了比较。固定化酶在 55下水解 10 批淀粉溶液，总反应时间超过 24 h，活力无显著变化。扬州教育学院郭海学 5以纤维素为载体，通过重氮化法固定葡萄糖淀粉酶，研究了 pH 及加酶量对酶固定化影响；并对固定化酶的性质进行了探讨，发现固定化酶的最适 pH 为 4.5，最适温度为 60，比游离酶具更高的热稳定性和较大的米氏常数。 甲壳素和壳聚糖含有相当多数量的游
10、离氨基，这些氨基可以和双功能试剂（如戊二醛等）发生交联作用，成为酶的固定化载体。山西农业大学郭伟利、侯红萍 6以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附交联法固定化糖化酶，对给酶量、戊二醛添加量、交联温度、交联时间等因素进行了考察；并对固定化酶的酶学性质进行了研究，结果表明：固定化的最佳条件为：浓度为 0.5 mg/ml，酶液 8 ml，1 %戊二醛溶液 4 ml，交联温度 45，交联时间 4 h；固定化酶的热稳定性和 pH 稳定性都优于游离酶；固定化酶连续使用 5 次，酶活仍保持了 58 %。武汉工业学院张剑等人 7通过对 4 种 壳聚糖载体固定化糖化酶的研究比较。结果表明：酸法水解制得的壳聚糖载体无
11、论从热稳定性、单位载体固定酶量，还是从回收率方面来看，都不及只经碱法处理的壳聚糖载体好。只经碱法处理的甲壳素载体制作的固定化酶，其性能与脱乙酰度的高低有关，脱乙酰度愈高，其性能愈好。脱乙酰度为 84. 6 %的壳聚糖载体有好的固定化性能，其酶回收率达 75 %；最适 pH 为 6.07.5；最适温度为 50；米氏常数为 22.63 mg/ L，对底物的亲和力增强。(三)吸附法和交联法吸附法是一种较古老的方法，其操作简便，处理条件温和，可回收利用。与共价结合法相比，该法制取的酶高级结构很少发生改变，但与载体结合较差，外界条件变化容易引起酶解析。一般来说，吸附法分为物理吸附和离子吸附两种。常用来作
12、为物理吸附的惰性体有活性炭、酸性白土、硅藻土和氢氧化铝等。吉林大学陈尊、周慧等 8合成了淀粉接枝丙烯猜及丙烯酞胺的两亲性高分子化物，并以此为载体，用物理吸附方法固定化了糖化酶，最适偶联条件研究表明：缓冲液的浓度、pH 值及吸附时间和加酶量都对固定化晦活力，比活有一定的影响，在最适固定化条件下，固定化酶的活力为1500U/g 干胶，蛋白载量为 25mg/g 干胶，比活为 60U/mg 蛋白，比天然酶的比活（8.0U/mg 蛋白）提高 6 倍。最适反应温度比天然酶提高 10（天然酶最适反应温度为 50） ，无底物存在下，固定化酶在 55 的半衰期为 24h，而天然酶只有 1h；有底物存在下，固定化
13、酶在 55的半衰期为 220h，45 的操作半衰期由外推法算得为 695天，而且该载体对糖化酶有一定的保护作用，当固定化酶在低于 55热处理一段时间后，对酶活力有激活作用，酶活力最大可提高 40%。该载体合成简单，固定化方法简单，步骤少，因而为工业上应用提供了一种新的可能性。吸附法也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，pH 值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。因此，其应用受到限制。为提高其适用性能，一部分科研人员将此法与其他方法联用。交联法是用多功能试剂与酶蛋白之间发生交联，即有酶分子之间的交联也有一定的分子内交联。根
14、据使用条件和添加材料的不同，可以获得不同物理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、甲苯双异酸盐、1, 5二氟2, 4二硝基苯等，交联试剂一般价格昂贵。此法也很少单独使用，因为机械性能和稳定性不好是其应用的一大约束，一般都将其作为其它方法的辅助手段，以达到更好的固定效果。(四)其它方法除采用上述几种方法固定糖化酶外。目前较为先进的就是几种方法的连用和双酶法。内蒙古师范大学邱广亮等 9以两亲性的聚乙二醇胶体粒子，通过吸附一交联法固定化糖化酶。研究了戊二醛浓度、缓冲液 pH 值及加酶量对酶固定化的影响，固定化酶活力可达 17095U /g 干胶，活力回收为 63%。磁性固定化酶最适温度比天然酶提高5
15、，最适 pH 比天然酶提高 0.5。并且对酸、碱、热的稳定性大大增强，贮存及操作稳定性也大大提高。该磁性载体合成简单，固定化方法简便，具有磁性，易于分离，因而为工业上的应用提供了一种新的可能。吉林大学酶工程实验室罗贵民等 10进行淀粉酶和糖化酶的共固定化研究。他们以纤维素为载体，用重氮化同时固定这两种酶，发现共固定化酶比固定化单酶能更好地发挥协同效应，催化效率也高，并能在较低温度下一步水解淀粉为葡萄糖，共固定化酶在 30下的操作半衰期可达 920 h。中国科学院龚伟中等 11研究以丙烯酰胺单体通过反向悬浮聚合技术合成聚丙烯酰胺作为载体材料，采用包埋交联法固定化葡萄糖淀粉酶，结果表明：该固定化酶
16、最适 pH值为 5.0，最适温度为 5558 ，而且具有较好的贮存稳定性和操作稳定性， 8 个月后该固定化酶的残余活力仍保持在 94%左右，可重复使用 43 批次，此固定化酶酶活回收率达到 56%。实验表明丙烯酰胺悬浮聚合固定化糖化酶的方法是简便可行的。二、固定化糖化酶的稳定性研究目前已有许多载体用于糖化酶的固定化，并获得一些稳定性较好的固定化糖化酶。这些固定化糖化酶在 45下大多有较好的反应稳定性。周剑平 12以聚乙烯醇复合凝胶作为载体固定化糖化酶，最终酶活力达到 1558U /g 干胶，酶活回收率为 30.2%。用该固定化酶在 pH4.6，45下进行连续操作。实验结果表明： 10%15%的
17、淀粉液经过水解后，DE 值均高于 95%，产物转化率最高可达到 98.2%，生产强度最高为 8.9g/Lh，6可连续使用 2428d。该固定化酶反应体系在高底物浓度下的操作稳定性和重复使用性较好。酶的固定化载体形状影响酶的稳定性。球状固化酶活力回收率及稳定性均优于丝状、膜状固化酶，这可能是因为形状的不同，酶包埋的深浅程度不同所致。丝状、膜状固化酶在使用过程中由于酶发生泄露等导致几次使用后酶活力明显下降。另外，球状的比表面较大，底物与酶接触更充分，从而表现出较高活性和较高的稳定性。与游离酶相比，酶经固定化后，酶分子的活动范围受到限制，因而限制了其与底物相接触，也导致固化酶活力降低。酶在固化过程中
18、，分子结构可能发生扭曲，活性部位结构发生变换，使得酶与底物的结合能力降低，从而导致固化酶活力降低。山西农业大学王家东等 13研究了海藻酸钠包埋糖化酶与海藻酸钠、壳聚糖混合包埋糖化酶所得固定化糖化酶的性质，两种固定化酶的最适温度和最适 pH 都一样，分别为 60和 4.6，包埋法制得的固定化酶的稳定性差，但当使用第 4 次时，出现活力上升现象，可能是因为在此期间固定化酶珠有部分从中间溶涨裂开，使部分糖化酶暴露在外，从而增大了固定化酶与底物的接触表面积，所以会出现活力突然上高的现象，活力随后又降低，可能是因为暴露出来的酶经过反应和反应过程中的摇动从载体上脱落的原故。从总的趋势来看，包埋法固定的酶的
19、活力下降的比较快：其一，可能因为部分酶分子从载体上脱落，造成固定酶量减少；其二，酶本身受外界环境的影响，其自身性质受到破坏，使其失活。包埋交联法制得固定化酶活力趋于稳定，但活力比包埋法制得的活力要低，可能是因为壳聚糖上氨基与戊二醛发生 Schiff 反应，再与酶形成 Schiff 碱而制得固定化酶，又由于壳聚糖分子结构中的氨基使酶易于固定，所以固定上的酶比较稳定，但由于空间阻力和戊二醛不仅是交联剂同时也是变性剂的原故，在发生反应时比较剧烈，所以酶活力损失大。可能由于交联的原故，其机械强度有所增强。总之包埋法制得的固定化酶的机械强度和稳定性比包埋交联法制得的固定化酶的差。三、展望糖化酶固定化研究
20、已有多年，但许多问题尚待进一步探索。国内外糖化酶的固定化技术很多，但仍存在着固定化酶活容量不高、不易保存等缺点。因此糖化酶的研究方向将集中在以下几个方面。( 1) 继续发展糖化酶的固定化技术，努力提高单位载体的固化酶活性容量，提高其使用寿命，扩大其使用范围。( 2) 深入研究糖化酶的酶学特性，进一步深入了解糖化酶的结构，探明糖化酶热稳定性机理，提高糖化酶基因的表达水平。( 3) 利用各种酶的特性改良技术，例如酶分子修饰技术、酶的非水相催化技术等。( 4) 进一步优化糖化酶提取精制工艺，采用先进的提取工艺和设备使糖化酶既是7高纯度、高活力的产品，又符合卫生标准。( 5) 进一步提高糖化酶的活力，利用诱变、DNA 重组技术或其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平。随着科技的进一步发展和研究的深入，固定化酶在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的进一步发展，糖化酶一定会发挥更大的作用，并且更好地造福人类。
