1、限制性内切酶的注意事项1)购买的限制性内切酶带有两种不同的酶切缓冲液，该用哪一种？每种限制性内切酶带有一管酶的最适反应液（通常是一种 4-CORE 反应液） ，可能还带有一只 MULTI-CORE 反应液。2)4-CORE 酶切缓冲液体系是什么？大多数（大约 75%）Promega 公司的限制性内切酶有一种最适酶切缓冲液，即 4-CORE 酶切缓冲液，分别叫作 A、B、C 和 D。其余的 25%的限制性内切酶带有一种特定的酶切缓冲液（酶切缓冲液 E-L） 。每一种限制性内切酶带有一只最适酶切缓冲液。3)MULTI-CORE 酶切缓冲液体系是什么？MULTI-CORE 酶切缓冲液适用于双酶切。每
2、一种 Promega 公司的限制性内切酶都测试了在 MULTI-CORE 酶切缓冲液中的活力，如果酶切活力达 25%，就提供一只 MULTI-CORE 酶切缓冲液。作双酶切时，如果两个酶在 MULTI-CORE 酶切缓冲液中的活力达到50-100%，就可替代 A-L 酶切缓冲液。应选用酶活力最高的酶切缓冲液。4)如何保存限制性内切酶？不太常用的限制性内切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20 oC。有一些酶需要不同的保存条件。每一种 Promega 公司的限制性内切酶都提供一份分析说明以供查讯。使用限制性内切酶时，应将酶保存在冰上。5)一般的限制性内切酶反应中（也叫消化） ，应用多
3、少内切酶？所用的酶量取决于 DNA 的纯度、量和型态。限制性内切酶的活力单位定义为在适当的温度下，在 1 小时内，1ugDNA 在 50ul 体积中，被完全消化所需的限制性内切酶的量。一般说来，线性 DNA 比超螺旋 DNA 更易消化。比如，酶切 1uglambdaDNA，需要 1-2 单位的酶，而酶切 1ug 质粒 DNA，需要 3-5 单位的酶。6)使用限制性内切酶的一般步骤是什么？一般步骤如下：A）测试酶切 DNA 的量B）计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于 8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的 10%（甘油的浓度为 5%） 。C）10X 反应液的体积应为终体积的 1/
4、10；10X 反应液的体积不应小于酶的体积。D）加入计算好的 DNA，10X 反应液，酶。加入水到终体积（20-50 ul） ，轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为 37 oC，但有例外。应查讯分析说明。比如：质粒 DNA （2ug/ ul） 5 ul10X 反应液 5 ul酶（5ug/ ul） 5 uldH2O 35 ul50 ul37 oC 保温 2-3 小时。应最后加酶。7)一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么（比如双酶切）？一次使用两个限制性内切酶的一般步骤，如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力。甘油的浓度不应超过终体积
5、的 8%。应注意有些酶对末端敏感，活力差。8)能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？可以，一般而言，甘油浓度超过 8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星活力。限制性内切酶提供在 50%的甘油中，故 10 ul 反应体积中不应加入超过 1.6 ul 的酶。9)消化反应中是否需要加牛血清白蛋白（BSA ）？不需要。酶切不需要加 BSA。但 Promega 公司的限制性内切酶活力测定时，均加入乙酰化的 BSA 达 0.1mg/ml。BSA 可以提高许多限制性内切酶活力。Promega 公司的限制性内切酶均提供一管乙酰化的 BSA（R396D，E，F ） ，并建议酶切时加入 BSA 达 0.
6、1mg/ml。10)星活力是什么？星活力是指在保温条件改变，如 NaCl 过多存在于反应液中，使酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列。11)什么是同切酶？同切酶指两个酶的识别位点和酶切位点相同，如 SphI(CGTACG)和 BbuI(CGTACG)互为同切酶。12)什么是 neoschizomer？Neoschizomer 指两个酶的识别序列相同，但酶切位点不同，如 SmaI(GGGCCC)和XmaI(GGGCCC)互为 neoschizomer。13)基因组规格指的是什么？基因组规格的酶适用于酶切包裹在琼脂中的基因组 DNA。另外，染色体 DNA 的制备、酶切和凝胶分离的条件对基因组规格的
7、酶作了优化。14)如果一个限制性内切酶不是基因组规格，是否表明它不能用于处理染色体 DNA？不一定。如果一个限制性内切酶不是基因组规格,Promega 公司没有测试它能否处理包裹的基因组 DNA。因此需作一些测试来决定酶是否会切割底物。15)需要用多少单位的限制性内切酶对琼脂包裹的染色体 DNA 进行酶切？切割包裹的 DNA 比普通底物需要更多的酶，一般需要多 2 倍。16)什么是蓝/白克隆测试？蓝/白克隆测试是一种确定酶切样品中，存在的少量外切核酸酶活力的质量检查过程。通过测定一个功能基因（Beta-半乳糖苷酶）酶切和重新连接后，蓝/白斑的比例，来确定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活
8、力，或不存在外切核酸酶活力，得到的是蓝色菌落。产生粘性末端的酶实验产生的白色菌落应小于 2%，而产生平头末端的酶实验产生的白色菌落应小于 5%。这个方法的灵敏度很高，可以检测出缺失一个碱基的酶切末端。17)限制性内切酶是如何命名的？限制性内切酶命名的次序如下：A） 用 3 个字母代表来源的生物（如 Bam 代表 Bacillus amyloliquefaciens）B） 1 个字母或阿拉伯数字代表菌株（BamH）C） 1 个罗马字母代表发现或鉴定的次序（BamHI ）18)如何稀释限制性内切酶？如果 1 小时内会使用限制性内切酶，可用补充有 0.5mg/ml BSA 的 1X 反应液稀释，如果在更长的时间内才会使用限制性内切酶，用酶贮存液稀释。
