1、实验七 还原糖的测定（3，5-二硝基水场酸比色法）一、目的：掌握还原糖定量测定的基本原理， 学习比色定糖法的基本操作，熟悉 723 型公光光度计的使用方法。二、原理：各种单糖和麦芽糖是救灾原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。在碱性条件下，还原糖与 3，5-二硝基水杨酸被共热，3，5- 二硝基水场酸还原为 3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质） ，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围愉，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅成一定比例关系，在 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。三、实验材料、仪器和试剂：（一）实验材料：面粉（二）仪器：1、25 毫
2、升血糖管或刻度试管*9 2、大塑料离心管 3、烧杯 100 毫升1 4、容量瓶：100 毫升1 5、恒温水浴 6、沸水浴 7、离心机 8、扭力天平 9 分光光度计（三）试剂1、 1 毫克/毫升葡萄糖标准液：准确称取 100 毫升分析纯还原糖（预先在 80烘至恒重） ，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100 毫升的容量中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。2、3，5-二硝基水杨酸试剂：将 6.3 克 3，5- 二硝基水杨酸和 262 毫升 2mol/LNaOH 溶液加到 500 毫升含有 185 克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5 克结晶酚和 5 克亚硫酸钠，搅拌至溶解。冷
3、却后加蒸馏水定容至 1000 毫升，贮于棕色瓶中备用。四、操作步骤：（一）制作葡萄糖标准曲线：取 7 支具有 25 毫升刻度的刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为 1 毫克/毫升的葡萄糖标准液和 3，5-二硝基水杨酸试剂。0 1 2 3 4 5 6葡萄糖糖标准液（毫升）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水（亳升）2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.83，5-二硝基水杨酸试剂（毫升）1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5将各管摇匀，在沸水中加热 5 分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容到 25 毫升刻度处，用
4、橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。在 540nm 波长下，用0 号管调零，分别读取 16 管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。管号数量项 目（二） 、样品中还原糖含量的测定：1、样品中还原糖的提取：准确称取 3 克食用面粉，放在 100 毫升的烧杯中，先以少量蒸馏水，搅匀，置于 50恒温水浴中保温 20 分钟，使还原糖浸出。然后转入大塑料离心管中，4000 转/分离心 5 分钟，上清全部收集到 100 毫升的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。2、显色和比色：取 2 支具有 25 毫升刻度的刻度管，编号，按下表所示的量，准确加入待测液和试剂。还原糖测定管号1 2还原糖待测液（毫升） 15 15蒸馏水（毫升） 05 053，5-二硝基水杨酸试剂（毫升） 15加完试剂后，其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同，测定各管消光值。五、结果与计算：以管（1） 、 （2）的消光值平均值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。按以下式计算出样品中还原糖的百分含量。提取液总体积 还原糖%= 查曲线所得还原糖毫克数 测定时取用体积 100样品毫克数六、附注：1、离心比过滤易得清液。2、标准曲线线作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。管号数量项目
