1、1灵芝多糖提取方法的研究天津市医药职工大学 05 中制大专 8 班 季君摘要：将各种中药处理新技术应用于灵芝多糖的提取研究，并筛选出最佳提取工艺条件。通过对回流提取法、微波提取法、超声提取法、酶解-回流提取法 4 种方法进行对比，得出灵芝多糖提取的最佳方法：酶解-回流提取法。再蚁媒用量，料液比，酶解温度，提取温度等对酶解-回流提取法进行单因素试验，初步确定各因素的最佳范围。通过进一步的正交试验，得出最佳工艺条件为以水为溶剂，料液比 112，20 l/g(相 对灵芝干重)植物复合水解酶，50酶解1.5 h，100提取 2 次。结论 ：灵芝多糖提取的最佳方法是酶解-回流提取法，而且采用酶解辅助提取
2、灵芝多糖，可以明显 提高多糖的提取率。关键词：灵芝；多糖；提取；酶解前言：灵芝多糖是由 10 个分子以上的一种或多种单糖连接而成的大分子化合物 1是一切生命机体必不可少的成分，具有多种生物活性。有文献 2报道灵芝多糖对机体具有令人满意的免疫增强作用。还有报道 显示，灵芝多糖 对异常增高的血糖有降低作用，而且可以减少放射性物质对机体的损害，促进 机体核酸和蛋白质的合成。据文献 3报道，生物 酶解技术、超临界流体萃取技术、微波技术、超声波技术等已广泛应用于中药有效成分的提取工艺中。目前，关于灵芝多糖提取工艺研究的文献报道较少，张仁权等 4报道了灵芝多糖的提取及含量测定，但并没有对灵芝多糖提取工艺进
3、行优化筛选。本次将生物酶解技术、微波技术、超声波技 术应用于灵芝多糖的提取工艺研究，通过对 4 种提取方法的综合比较，确定最佳提取方法，然后 对其进行工艺优化筛选，得出最佳提取工艺参数，可 为 灵芝多糖的结构表征、活性功能 实验以及灵芝多糖产品的工业化生产奠定基础。一、灵芝多糖成分和结构：21灵芝多糖是灵芝叶片中主要功能性成分。灵芝叶中的多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖组成，其相 对含量甘露糖为 60.73，半乳 16.42，阿拉伯糖5.45，鼠李糖 4.42葡萄糖 9.16，木糖 3.83。 用两万分子量以上的灵芝多糖进行免疫功能等项药理实验，在 5mg/kg 的浓度下，
4、具有促进免疫功能的作用。从灵芝叶中分离得到三种多糖：A60b，A90a，A90b，分子量分 别是 12000，47000 和 12000。A60b 的结构为 -(14)连接的甘露聚糖，在 2,3 或 6 位上部分乙酰化。 A90b 的结构为 -(14)结构的直链俯萄-甘露聚糖。实验证明 Aloe china 中灵芝多糖的含量较高。另外， 对 Aloe Arborescens 与 Aloe china 的碳水化合物的组成进行比较分析，Aloe china 中除了多含有葡萄糖醛酸外，和 Aloe Arborescens 一样均含有可溶性糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和微量木糖。两种灵芝多糖的组成 A
5、loe Arborescens 是以半乳糖为主，还有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成的中性杂多糖；而 Aloe vear 是以甘露糖为主，其次 为半乳糖、葡萄糖、和阿拉伯糖组成的酸性杂多糖。南斯拉夫科学家对 Aloe Arborescens 中酸性多糖进行了较为深入的研究，发现它是由 D-葡萄糖和 D-葡萄糖醛酸以 9：1 分子比组成的分枝多糖。也有人指出，Aloe Arborescens 中的主要多糖为部分乙酰化的葡萄-甘露聚糖，其分子量为 1,5000 左右，并指出这种多糖对 S-180 有抑制作用。Gowda 等人报道 Aloe vear 中至少存在四种多糖，都是不同程度乙酰化的葡萄-甘露聚
6、糖。对 分离得到的免疫调节 活性多糖进行了细致的结构分析，结果表明此类多糖的主链主要是由 Man:Glc:Gal:GalA:Fuc:Ara:Xyl 以 120：9：6：3：2：2：1 的比例组成的以及痕量的 4,6-Galp 和 3,6-Galp；水解后得到的产物主要是短链的低聚糖和一抗酸片断的混合物。总之，科学家试图通过灵芝多糖结构的精细研究揭示其结构与功能之间的构效关系。2、灵芝叶的新鲜汁液含灵芝大黄素、灵芝大黄素苷、异灵芝大黄素苷、对香豆酸、少量蛋白质及许多草酸钙的结晶。各种灵芝属植物皆含蒽醌衍化物。灵芝大黄素(Aloeemodin),灵芝大黄素苷(Aloin,barbaloin),为淡
7、黄色结晶性苷，灵芝泻3素蒽酚或灵芝泻素蒽酮，灵芝大黄素苷的异构体异灵芝大黄素苷(Isobarbaloin),高塔尔灵芝素(Homonataloin)，蒽酚(Anthranol) 大黄酚(Chrysophanol),大黄酚葡萄糖苷(Chrysophanolglucoside)等蒽类及其甙类，以及榭皮素(Quercetin),莰非醇(Campherenol),芦丁(Rutin)等黄酮类和亦含有精氨酸，天冬酰胺，谷氨酸等人体必需的八种氨基酸，以及胆固醇(Cholesterol),菜油醇(Fructose),谷醇(Sitoterol).还含有酸(Capricacid),月桂酸(Lauricacid),
8、肉豆蔻酸(Myristicacid),油酸(Oleicacid),亚油酸(Linoleicacid),棕榈油酸(Palmitoleicacid)，琥珀酸(Succinicacid),乳酸(Lacticacid)等脂肪酸类物质，以及钾，钠，铜，锌， 铬等二十多种无机元素和维生素等物质 。灵芝大黄素(Rhabarberone)异名：灵芝泻素结构式：物理性状：橙色针状结晶(甲苯)，熔点223224 度，易溶于热乙醇，在乙醚及苯中显黄色，氨水及硫酸中显绯红色。植物来源：蓼科植物掌叶大黄 RheumPalmatumL.根茎，药用大黄 R.officinaleBaill.根茎,巴天酸模RumexPatie
9、ntiaL.根,齿果酸模 R.dentatusL.叶,豆科植物山扁豆 CassiamimosoidesL.根,决明 C.toraL.种子,望江南 C.occidentalisL.种子,鼠李科植物鼠李RhamnusdavuricaPall.果实灵芝大黄素甙(Aloin)异名:灵芝甙,灵芝素(Barbaloin)结构式：物理性状:柠檬黄结晶,熔点 148149 度(乙醇),一水合物熔点 7080 度,略带沉香气味,味苦,易溶于吡啶,溶于冰醋酸,甲酸,丙酮,醋酸甲酯,以及乙醇等.植物来源：百合科植物库拉索灵芝 Aloevera.L.叶.灵芝宁(Aloenin)异名:Aloearbonaside 结构
10、式：物理性状:一水合物熔点 145147 度,无水物熔点 204205 度(氯仿-甲醚),植物来源:百合科植物斑纹灵芝AloeveraL.var.chinensis(Haw.)Berger 叶3、灵芝中含有纤维素酶、缓激肽酶、过氧化氢酶、淀粉酶、蒜氨酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）、4木糖酶以及脂酶等等，其中不乏对人类大有裨益的酶，灵芝中的酶类、蒽 醌类和多糖类物质是其生物体中主要活性成分，加之维生素、 矿物质元素构成了一个鲜活的整体，然而我 们对这个复杂的生物体本身知之甚少。在初级原料加工中， 为了产品性状，蒽 醌类物质被去除，酶被灭活，甚至在其中加入化学防腐剂，最 终仍旧导致产品较初始原料生
11、物活性大大下降。4 灵芝素具有抑制胶原酶和金属蛋白酶活性的作用，另有研究表明存在少量灵芝素不以游离状态存在，而是在新鲜凝胶中共 轭成配糖体，当 酶作用于配糖体 时，灵芝素才能被游离出来。是不是灵芝中的多糖、酶、灵芝素之 间存在相互制约 的关系呢？他们在灵芝植株内是怎样的一种平衡关系？灵芝是怎样做到多糖成分不被纤维素酶过度的分解的？也许我们不应该将这几大类活性物质分开进行独立的研究，或 许我们更应该从生化的角度进一步认识它们之间的相互关系，只有清楚地掌握了他们的关系，我 们才能利用灵芝的神奇功效造福于人 类，找到更加合理的生产工艺，开发出更加天然的 稳定的产品。二方法1 灵芝多糖不同提取方法基本
12、工艺流程提取工艺为原料过筛乙醇回流水提取过滤滤液离心回流法称取灵芝样品 5 g，加 80%乙醇 50 ml，90水浴回流 1 h，重复 1 次，过滤， 滤渣挥干乙醇，加 75ml 蒸馏水，浸泡 1 h，100水浴回流 1 h，重复提取 2 次，合并提取液，离心，取上清液定容至 250 ml，测 定吸光度，制 备灵芝粗多糖。微波法 5，微波重复提取 3 次（每次加热至沸腾，静置 1 min，再加 热至沸腾，反复 5 次），合并提取液，离心，取上清液定容至 250 ml，测定吸光度，制备灵芝粗多糖。超声法 6，放进超声波发生器，超声提取 30 min，再重复提取 2 次，合并提取液，离心，取上清液
13、定容至 250 ml，测定吸光度，制 备灵芝粗多糖。酶解-回流法 7，加 0.1 ml 复合酶， 55酶处理 1.5 h，然后 100水浴回流提取 1 h，重复提取两次，合并提取液，离心，取上清液定 容至 250 ml，测定吸光度，制 备灵芝粗多糖。52 灵芝多糖的含量测定及制备提取液多糖含量测定用蒽酮-硫酸法测定 8。灵芝粗多糖的制备取测定过吸光度的灵芝提取液，真空浓缩至 50 ml，浓缩液中加入无水乙醇至醇浓度达到 70%，于 4冰箱中过夜，再离心分离，滤渣放进烘箱中（50）干燥，称重，计算得率。灵芝多糖复水性实验精密称取 105干燥至恒重的灵芝多糖 10 mg，置于小 烧杯中，加蒸馏水溶
14、解，然后转移至 50 ml 容量瓶中并稀释到刻度，配成 0.2 mg/ml 的灵芝多糖溶液，按2.2.1节含量测定方法测定吸光度 A。3酶解-回流法工艺优化酶解-回流法提取条件单因素实验在酶解-回流提取灵芝多糖时，影响其提取率的主要因素有 9：提取温度、酶用量、料液比、 酶解温度、提取次数。通过单因素实验确定它们作用的合适范围，为酶解-回流法提取灵芝多糖正交 实验提供数据。酶解-回流法提取条件的正交设计及实验，根据单因素试验结果，确定各正交设计因子的水平，对酶 解-回流法提取工 艺进行研究，确定灵芝多糖酶解-回流提取法的最佳工艺参数。酶解-回流法最佳工艺放大实验准确称取 20g 灵芝样品 3
15、份，在 2.3.2节优化的工艺条件下，即酶解温度为 50，料液比 为 112，酶用量为 20 l/g，提取，离心，定容，测定吸光度A值，计 算灵芝多糖提取率。结果1 灵芝多糖不同提取方法结果比较分别选用两份样品进行灵芝多糖不同提取方法的比较试验，每组实验做 3 个平行样，各 组提取液吸光度 测定结果的 RSD 值均小于 3%，粗多糖重测定结果的 RSD 值均小于 5%，复溶吸光度的 RSD 值均小于 3%。64 种提取方法综合评价：根据各指标在提取工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系数，以标准化后的值加权后求和，即得 综合评价 Y值，其中 Y=吸光度3粗多糖重4复溶吸光度3。对 4 种提取方
16、法的实验结果进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响，同时根据各指标在工艺选择中的主次，确定不同的加权系数，以标准化处理加 权求和后的 Y值为综合指标，评判 4 种提取方法的优劣， 较各评价指标直接相加更加科学、合理。由以上结果可以看出，如果采用两个灵芝样品，以提取液吸光度、粗多糖重、粗多糖复溶吸光度为衡量标准综合考虑，则酶解-回流法的综合评价指标回流提取法微波提取法超声提取法。可见，经酶解 处理后可明显提高灵芝多糖的提取率。由于植物提取过程中的屏障-细胞壁被破坏，因而酶法提取有利于提高有效成分的提取率。本文所采用的 酶解-回流法，其灵芝多糖提取效
17、果优于传统提取方法。王士刚等 10报道，采用纤维素酶和菠萝蛋白酶， 对香菇及香菇柄的提取进行酶解处理，可以提高香菇多糖的提取率。于淑娟等 11人对超声波酶法提取灵芝多糖的机理进行了研究， 结果表明， 该法具有水解效率高，产品质量好等优点，同时还能缩短提取周期，并使反 应条件更加温和。本文通过对 4 种提取方法的对比研究，经综合考虑最终确定酶解-回流法为最佳提取方法，灵芝多糖酶法提取的文献未 见报道，因此，需对酶解-回流法的工艺条件进一步优化以确定最佳提取工艺参数。2灵芝多糖酶解-回流法提取单因素 提取温度对多糖提取的影响结果是:提取温度越低，能耗越少，且有效成分不会被破坏，所以如果提取率相当，
18、应该尽量采用较低的温度以减少能耗，防止有效成分的破坏。上述实验结果表明，80或 90的提取效果不佳，灵芝多糖提取不充分，所以提取温度选在 100为宜。酶用量对灵芝多糖提取的影响结果是：7在同样条件下，多糖提取率随酶用量的增加而增加，但是当酶用量超过 40 l 后多糖的含量反而有所减低，所以酶用量在 40 l 时多糖的提取效果较好，目前生物酶制剂价格较高， 酶用量直接决定灵芝多糖生产成本的高低，因此需采用正交试验对酶用量进一步筛选。料液比对灵芝多糖提取的影响结果是：料液比越小，提取越彻底，但会增加浓缩的工作量、试剂用量和成本，一般料液比 为 18120。由实验结果可知，随着料液比的减小，多糖的提
19、取率会随之增加，但是料液比低于 115，提取率增加并不明显，因此最佳料液比为 115，考虑到料液比的变化会影响酶用量，需 进行正交实验进一步确定最佳料液比。酶解温度对灵芝多糖提取的影响结果是：酶都有其最适温度或最适温度范围。在一定的范围内，温度升高，反应速度加快；但温度超 过一定程度 时，又促 进了酶蛋白的变性反应。酶解温度在 5055范围内其活性最大， 综合考虑，进 行正交实验以确定最佳酶解温度。提取次数对多糖提取的影响结果是：提取 2 次，3 次，4 次的多糖提取率相差不大， 综合考虑工业化生产成本及周期，采用 2 次提取。灵芝多糖提取正交实验结果以水为提取剂，选择酶解温度，料液比， 酶用
20、量为考察因素，以测得灵芝样品中多糖含量为指标，对灵芝多糖提取工艺进行研究。结果表明：灵芝多糖采用酶解-回流法提取，酶用量，酶解温度对灵芝多糖有显著性影响，而料液比影响不大，各因素对提取效果的影响程度依次为：酶用量酶解温度料液比，优选工艺为 A1B2C2，即酶解温度 为 50，料液比 为 115，酶用量为 20 l/g，因料液比对灵芝多糖的提取率影响不明显，考虑到工 业化生产中后处理困难，所以选 112为最佳料液比。酶解-回流法最佳工艺条件放大实验结果最佳工艺条件放大验证实验结果。本文结果表明，放大实验测定结果与预测结果基本接近，说明该工艺稳定可行，适合灵芝多糖提取。结论8本实验首次将生物酶解技
21、术、微波技术、超声波技术应用于灵芝多糖的提取工艺研究，对灵芝多糖提取新工艺进行了初步探讨。本实验以灵芝多糖水提液吸光度、粗多糖得率、粗多糖复水性为评价指标进行了研究，至于不同提取方法对灵芝多糖结构以及灵芝多糖的各种理化性质的影响则有待进一步探讨。灵芝中含有丰富的多糖，采用酶解-回流法提取灵芝多糖，在优化的工艺条件：以水为溶剂，料液比 112，20 l/g(相 对 灵芝干重)植物复合水解酶， 50酶解 1.5h，100提取 2 次，灵芝多糖提取率高达 17.3%。该结 果可为灵芝多糖提取的工业化生产提供理论参考依据。参考文献1中国科学院上海药物研究所.中草药有效成分提取与分离M.上海:上海科学技
22、术出版社,2004：4152孟凡征,李柏.西洋参M.北京:北京科学技术出版社,2003：323韩丽.实用中药制剂新技术M.北京:化学工业出版社,2002：114张仁权,吕洁平,程怡.西洋参参须废渣中参多糖的提取及含量测定J.中药新药与临床药理,2001,12(2).5傅博强,谢明勇,周鹏，等.纤维素酶法提取茶多糖J.无锡轻工大学学报,2002,21(4)6傅博强,谢明勇,聂少平，等.茶叶中多糖含量的测定J.食品科学,2001,22(11).7杨云,谢新年,孟江.酶法提取大枣多糖的研究J.食品工业科学与技术,2003,24(10).8陈瑶,韩婷,秦路平，等.正交设计法选积雪草总甙的提取工艺J.中药材,2003,26(3).9.许禄.化学计量学方法M.北京:科学技术出版社,2005：149-151.10.王士刚,封毅. 香菇营养成分的提取及香菇饮料的研制J.食品科学,1994,8.11.于淑娟,高大维,李国基.超声波酶法提取灵芝多糖的机理研究J.华南理工大学学报(自然科学版),1998,26(2)致谢 本文是在 赵晶老师的精心指导和大力支持下完成的。在论文的选题、资料查询及定7稿过程中,都给予我无私的帮助和悉心的指导，本人在此献上最真挚的感谢，
