1、细胞培养基上清提取外泌体外泌体产生细胞（Exosome 源细胞）的选取：293T 细胞：常用于基因改造外泌体；Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小；Mouse lymphoma cell line（EL-4） ：小鼠淋巴细胞；各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究:不同实验的需求不同， Exosome 源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的 293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。Exoso
2、me 源细胞用量：以 293T 为例，2 个 15cm 盘=4.5 个 10cm 盘=4*10 7 cells，最终的 Exosome 20ul/20ul可用于体内原位癌 3*104/1ul 注射给药，15ul/50ul 可用于 105 受体细胞培养加药。PS: 王红阳方法 1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量 5ug，10 5 细胞培养用量 1ug。我约莫算了一下，差不多。楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。以 293T 细胞为例制备 Exosome：1.2 盘 10cm 盘在 60-70%进行病毒感染， 1 盘感染 GFP（control 病毒），1 盘感
3、染 plv-cs2.0-myc-PD1，病毒感染后 16-18h 后换液；2.36-48h 后进行传代：准备 10 盘 10cm 盘，每盘加入 15ml Exosome-free 的 10%血清的DMEM，放入 37C 培养箱备用。取出 2 感染好的 2 盘细胞，迅速用 5ml PBS/遍 洗涤 3 遍 ，加入 1ml 胰酶， 摇匀使每个细胞都孵育胰酶， 37C 静置消化 1min，加入 4ml Exosome-free 的 10%血清的 DMEM 静置，获得 5ml 细胞悬液，加入到准备好的 10 盘 10cm 盘中，获得 5 盘 GFP、5 盘 plv-cs2.0-myc-PD1 稳转 2
4、93T 细胞系，37C 培养 48h；3.取 4 根灭菌处理过的 50ml 管，收集细胞培养基，分装成 37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1 各两管，进行三步法离心： 4C 离心 200-300g，5min 去细胞，分别小心吸取上清 34ml 入新的灭菌 50ml管； 4C 离心 12,000-16,000g，45min 去碎片，分别吸取 31ml 上清入新的灭菌50ml 管，0.22um 滤膜（Millipore）过滤，最后 62ml 左右汇入一管 Beckman 快速密封管 Beckman Quick seal tubes； Beckman 70Ti 转子 4C 超离 100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS 重悬 exoxome。3. 收取上清，进行三步法离心：200-300g 5min 去细胞；12,000-16,000g 45min 去碎片，0.22um 滤膜过滤，用 100kDa 的超滤管（Millipore）将上清浓缩至 200ul，加 入15ml PBS 浓缩至 50ul。4.取 1、3、5 、15ul/50ul 的 Exosome 加入 105受体细胞中，培养 48h，观察或检测目的基因、药物的摄入情况。（GFP 观察荧光，RNA 用 RT-PCR，蛋白用 WB）。
