1、Cell Nucleus and Chromosome,第八章 细胞核与染色体,间期的细胞核的形态结构,典型的真核生物细胞核的结构由4个主要组成部分：核被膜、染色质、核仁及核骨架。,外核膜 内核膜 核纤层 核周间隙 核孔复合体,（一） 核被膜的结构(Structure of the Nuclear Envelope),外核膜 内核膜 核纤层 核周间隙 核孔复合体,（一） 核被膜的结构(Structure of the Nuclear Envelope),核纤层,核纤层由核纤肽（lamin）构成，是一类中间纤维。核纤层的作用有以下两个方面： 1保持核的形态 2参与染色质和核的组装,（二）核被膜在
2、细胞周期中的崩解与装配,新核膜来自旧核膜 核膜装配的机制及其与核孔复合体、核纤层的关系，目前尚无定论 核被膜的解体与重建的动态变化受细胞周期调控因子的调节，调节作用可能与核纤层蛋白、核孔复合体蛋白的磷酸化与去磷酸化修饰有关。,在真核细胞的细胞周期中，核被膜有规律地解体与重建。,核孔由至少50种不同的蛋白质构成。核孔在核膜上的密度很大，一个典型的哺乳动物细胞核膜上有3000-4000个核孔。转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。,核孔复合体（nuclear pore complex，NPC）,已知所有的真核细胞，间期细胞核普遍存在核孔复合体。,电镜下显示的核孔复合体,Cytoplasmic
3、face cytoplasmic particles,两栖类卵细胞分离的NPC的细胞质面, 细胞质颗粒覆盖在NPC的胞质环上;,Nuclear facebasket inner complex,当观察NPC核质面时, 可以看到与核孔复合物相连的篮,（1）从横向上看，核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚单位； （2）从纵向上看，核孔复合体由核外（胞质面）向核内（核质面）依次可分为胞质环、辐（栓）、核质环三种结构亚单位。 综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分：,胞质环 核质环 辐 中央栓,核孔复合体结构模型,核孔蛋白”（nucleoporin，Nup）,核孔复合体主要由蛋
4、白质构成，其总相对分子质量约为125106，推测可能含有100余种不同的多肽，共1 000多个蛋白质分子。 gp210：结构性跨膜蛋白 p62：功能性的核孔复合体蛋白，具有两个功能结构域,（二） 核孔复合体成分的研究,已知的脊椎动物核孔复合体的蛋白成份简表,gp210：结构性跨膜蛋白, 介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，从而为核孔复合体装配提供一个起始位点 在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用 在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定作用,p62：功能性的核孔复合体蛋白，具 有两个功能结构域 疏水性N端区：可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换 C端区：可能通过与其
5、它核孔复合体蛋白相互作用，从而将p62分子稳定到核孔复合体上，为其N端进行核质交换活动提供支持。,核孔复合体的功能,从功能上讲，核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输。 双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒（RNP）的出核转运,1. 通过核孔复合体的被动扩散核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为910nm，有的可达12.5nm，离子、小分子以及直径在10nm以下的物质原则上可以自由通过。,10nm,2. 通过核孔复合体的主动运输生物大分子的核质分配如亲核
6、蛋白的核输入，RNA分子及RNP颗粒的核输出，在细胞核功能活性的控制中起非常重要的作用。,被动运输（passive transport）小于10nm的分子自由出入主动运输（active transport） 具有入核信号的蛋白的入核 RNA分子 核糖核蛋白颗粒出核,主动运输的选择性表现在以下三个方面： （1）对运输颗粒大小的限制。主动运输的功能直径比被动运输大，约1020nm，甚至可达26nm。核孔复合体的有效直径的大小是可被调节的； （2）通过核孔复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要能量； （3）通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入与核输出，它既能把复制、转录、染色体
7、构建和核糖体亚单位组装等所需要的各种因子运输到核内；同时又能将翻译所需的RNA、组装好的核糖体亚单位从核内运送到细胞质。,核蛋白运输机制,基本概念亲核蛋白(nuclear protein)：在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。核定位信号(nuclear localization signals ,NLS)：NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基，如Lys、Arg，此外还常含有Pro,具有定向, 定位作用 。NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，在指导完成核输入后并不被切除。亲核蛋白入核转运还需要一些胞质蛋白因子的帮助。目前比较确定的因子有
8、importin、importin、Ran(一种GTP结合蛋白) 。,核定位信号(nuclear localization signals , NLS),核蛋白输入机理,（1）亲核蛋白通过NLS识别importin，与可溶性NLS 受体importin/ improtin异二聚体结合，形成转运复合物； （2）在importin的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合； （3）转运复合物通过改变构象的核孔复合体被转移到核质面； （4）转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放； （5）受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran-GTP 水解形成Ran-GD
9、P并与importin解离，Ran-GDP 返回核内再转换成Ran-GTP 状态。,NLS只是亲核蛋白入核的一个必要条件，某种亲核蛋白是否被转运入核还受到其它因素的影响。,染色质的概念,染色质（chromatin）指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。染色体(chromosome)指细胞在分裂过程中, 由染色质聚缩而成的棒状结构。 染色体与染色质二者之间的区别主要并不在于化学组成上的差异，而在于包装程度不同，反映了它们处于细胞周期中不同的功能阶段。,DNA分子一级结构具有多样性,非重复序列DNA(单一序列或1-5个拷贝)：编码序列
10、 中度重复DNA序列 （拷贝数在10个以上的序列称为重复序列，重复次数在102-105为中度重复序列）有些是调控序列有些是编码rRNA和 tRNA以及组蛋白的基因。但多数是不编码任何产物 高度重复DNA序列 （重复次数在105以上） 卫星DNA:是高度重复序列中AT含量很高的简单的高度重复序列。由于AT段浮力密度小, 所以在DNA片段进行CsCl密度梯度离心时, 常会在DNA主带上有一个次要的带相伴随, 因此称为卫星DNA。,(二)染色质蛋白质,染色质DNA结合蛋白负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。这些DNA 结合蛋白包括两类： 一是组蛋白（histone），与DNA非特异性结合；另一
11、类是非组蛋白（nonhistone），与DNA特异性相结合。,组蛋白(histone)：是真核生物染色体的基本结构蛋白, 是一类小分子碱性蛋白质,有5种类型, 即H1、H2A、H2B、H3、H4，它们富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。 染色质中的组蛋白与DNA的含量之比为：11。,五种组蛋白在功能上分为两组： 核小体组蛋白：包括H2A、H2B、H3和H4, 作用是与DNA组装成核小体,相对分子质量较小(102135个氨基酸残基), 它们的作用是将DNA分子盘绕成核小体。它们没有种属及组织特异性, 在进化上十分保守。 H1组蛋白：不参加核小体的组建,在构成核小体
12、时起连接作用,并赋予染色质以极性。H1有一定的组织和种属特异性。H1的相对分子质量较大, 有215个氨基酸残基, 在进化上也较不保守。,组蛋白的功能:,特性: 非组蛋白具多样性和异质性。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类如DNA和RNA聚合酶、核质蛋白、染色体骨架蛋白、肌动蛋白和基因表达调控蛋白等。对DNA具有识别特异性, 识别信息来源于DNA核苷酸序列本身，识别位点存在于DNA双螺旋的大沟部分。识别与结合靠氢键和离子键。 呈酸性、带负电荷。, 参与染色体的构建: 这方面的作用与组蛋白相辅佐。组蛋白把DNA双链分子装配成核小体串珠结构后, 非组蛋白则帮助折叠、盘曲, 以形成在复制和转录功能上相对
13、独立的结构域, 启动基因的复制: 以复合物的形式结合在一段特异DNA序列上, 复合物中包括启动蛋白、DNA聚合酶、引物酶等, 启动和推进DNA分子的复制。 调控基因的转录: 一般为基因调控蛋白它们往往以竞争性或协同性结合的方式, 作用于一段特异DNA序列上,以调节有关基因的表达,非组蛋白的功能,二、染色质的基本结构单位核小体,1974年Kornberg等人根据电镜观察和染色质的酶切降解，发现核小体（nucleosome）是染色质包装的基本结构单位，并提出染色质结构的“串珠“模型。,用温和的方法裂解细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，通过电镜观察，未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝，经盐溶液
14、处理后解聚的染色质呈现一系列核小体彼此连接的串珠状结构，念珠的直径为10nm,（1）电镜实验证据,（2）核酸酶水解从大鼠肝细胞中分离的染色质,用非特异性微球菌核酸酶消化染色质时，经过蔗糖梯度离心及琼脂糖凝胶电泳分析，发现绝大多数DNA被降解成大约200bp的片段；如果部分酶解，则得到的片段的大小是200bp的整数倍。,Gel electrophoresis after removal of chromatin proteins,Analyzed by electron microscopy,The basic repeat unit, containing an average of 200b
15、p of DNA associated with a protein particle, is the nucleosome,（3）应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒,核小体颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁园柱体，核心组蛋白的构成是先形成（H3）2,（H4）2四聚体，然后再与两个H2AH2B异二聚体结合形成八聚体。,3-D of nucleosome,Nature 389:251, 1997,用SV40病毒感染细胞，病毒DNA进入细胞后，与宿主的组蛋白结合，形成串珠状微小染色体，电镜观察SV40 DNA为环状，周长1 500nm，约5.0kb。若200bp相当
16、于一个核小体，则可形成25个核小体，实际观察到23个，与推断基本一致。,（4） SV40微小染色体（minichromosome）分析。,1.每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋、一个组蛋白八聚体和一分子H1。,核小体的结构要点:,2.由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒。 (H2A-H2B)-(H3-H4)-(H3-H4)-(H2A-H2B),15-50bp,3. DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，共1.75圈，约146bp，组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。,Core particle,4.
17、两个相邻核小体之间以连接DNA（linker DNA）相连,5. 组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列。Rich in positively charged basic amino acids, which interact with the negtively charged phosphate groups in DNA,6. 核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达如非组蛋白与DNA特异性位点的结合，可影响邻近核小体的相位；,球状组蛋白核心,DNA双螺旋(140-160bp、1.75圈）,H2A,H2A,H2B,H2B,
18、连接DNA（50-60bp）,核小体,核心部,连接部,DNA分子：140-160bp、1.75圈,组 蛋 白：2（H2A、H2B、H3、H4）,组 蛋 白：H1,DNA分子：5060bp,八聚体,DNA被压缩7倍,染色质的结构, 染色质包装的多级螺旋模型 (multiple coiling model) 染色体的骨架-放射环结构模型(scaffold radial loop structure model),三、染色质包装的结构模型,（一）染色质包装的多级螺旋模型,一级结构：核小体,每个碱基对长度为0.34nm ,200个碱基对的核小体DNA伸展开来的长度是70nm,一个核小体的直经是10nm
19、,二级结构：螺线管(solenoid),螺旋管是染色质的二级结构，6个核小体缠绕一圈形成的中空性管. 外30nm; 内10nm,组蛋白H1位于螺旋管内侧。将DNA分子长度压缩6倍，螺旋管即为30nm的染色质纤维。,螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4m的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色体包装的三级结构。,这种超螺线管进一步螺旋折叠，形成长210m的染色单体，即染色质包装的四级结构。,根据多级螺旋模型，从DNA到染色体经过四级包装：,该模型认为30nm 的染色线折叠成环，沿染色体纵轴由中央向四周伸出，构成放射环。,染色体的骨架-放射环结构模型,非组蛋白构成的染色体骨架,2nm DNA 11nm
20、nucleosome 30nm fiber Loop Metaphase chromosome,Evidence for Scaffold Radial Loop Model,中期染色体,染色质的分类,是指间期细胞内染色质丝折叠压缩程度高，处于凝集状态，用碱性染料染色时着色深的那些染色质。异染色质又分为结构异染色质或称组成性异染色质和兼性异染色质。,指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低, 处于伸展状态, 用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。,异染色质（heterochromatin）, 常染色质(euchromatin),No transcriptional activity;, 结构异染色质,
21、除复制期以外，在整个细胞周期均处于聚缩状态，DNA包装比在整个细胞周期中基本没有较大变化的异染色质。,人的胚胎发育到第16-28天，体细胞将随机保持一条X染色体有转录活性，呈常染色质状态；而另一条X染色体则失去转录活性，成为异染色质，形成染色深的颗粒，位于核膜边缘，在上皮细胞核内,这个X染色体称为巴尔氏小体 其子代细胞将延续这些特点。可用于性别鉴定。,barr body,巴尔氏小体（barr body）, 兼性异染色质,在某些细胞类型或一定的发育阶段, 原来的常染色质聚缩, 并丧失基因转录活性, 变为异染色质,染色质的类型,复习内容： 名词解释： 核孔复合体（nuclear pore complex, NPC） 核定位信号（nuclear localization signal,NLS） 核小体（nucleosome） 染色质（chromatin） 常染色质（euchromatin） 异染色质（heterochromatin） 结构异染色质（constitutive heterochromatin） 兼性异染色质（facultative heterochromatin）问答题： 1 核小体结构要点 2 核孔复合体的结构和功能 3 染色质组装的模型,
