1、标题：分子生物组检测程序性能验证标准操作程序文件编号:HBHTCM/LH-SOP-PCR- 版本号： 修改号：0生效日期：- 发行部门：PCR 组编制人： 审核人：Logo/医院检验科laboratory/lab批准人： 页码：第 1 页 / 共 4 页1 目的确立分子生物组检测程序性能验证标准操作规程，使检测程序性能验证操作规范化。2 适用范围采用基因扩增检验方法检测的所有项目。3 职责或责任人3.1 组长负责组织本组工作人员具体实施，并审核报告； 3.2 本组工作人员负责对适用范围内的检测程序进行验证操作，并撰写报告；3.3 技术主管负责监督本规程的实施； 3.4 质量主管参与对检验程序有
2、效性的评价及指导；3.5 检验科主任负责批准检测程序的实施。4 内容定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少应包括精密度、正确度、线性、测量和/ 或可报告范围、抗干扰能力等。定性检测项目验证内容至少应包括测定下限、特异性、准确度（方法学比较或与金标准比较） 、抗干扰能力等。4.1 正确度指该检测程序测定的结果与真实值或参考值接近的程度。4.1.1 验证方法：本组采用对照试验，将卫计委临床检验中心或湖北省临床检验中心的能力验证/室间质评的质控品、或已获认可的实验室的标本作为样品，以所用的检测程序对进行定量分析，分析结果与质控品靶值或比对实验室检测值进行比较，误差在可接受范围即可接受。4.1.2
3、样品数量：至少 5 份，包括正常和异常水平或不同常见基因突变型；4.1.3 频率：至少每年 2 次；4.1.4 判定标准：对于定性试验，阴阳性应该一致；对于定量试验，应有80%的结果符合要求，卫计委临床检验中心能力和湖北省临床检验中心验证评价界限靶值分别为 0.4 和 0.5，实验室间结果比对合格标准是偏倚7.5%。4.2 特异性指在可能其它成分（如其他病原体、内源物质等）存在的条件下，采用的方法能正确测定待测物的特性。对于核酸检测的特异性，主要是指核酸扩增过程中的特异性。4.2.1 验证方法：取一份阴性标本，加入其他常见病原体高浓度核酸样本，进行10 次独立的检测。4.2.2 判断标准：观察
4、并记录检测结果为阴阳性的差异。4.3 精密度标题：分子生物组检测程序性能验证标准操作程序文件编号:HBHTCM/LH-SOP-PCR- 版本号： 修改号：0生效日期：- 发行部门：PCR 组编制人： 审核人：Logo/医院检验科laboratory/lab批准人： 页码：第 2 页 / 共 4 页指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般以偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。4.3.1 验证方法4.3.1.1 重复精密度（批内精密度）：选择具有医学决定水平的高低值标本，按规定的操作方法，在较短得时间内及稳定的条件下各作 20 次独立测定。计算其均值、标准差与
5、变异系数。标本可用患者血清或选用质控品进行，所检测所有数据超出 2SD 的数据不能超过 2 个，否则应分析失控原因纠正后重新进行试验。 （可参照厂家说明书）4.3.1.2 中间精密度（批间精密度）：选择室内质控作为衡量中间精密度的依据。选取至少 2 个月的质控数据（浓度最好为医学决定水平之内和之外）计算均值、标准差与变异系数。4.3.1.3 重复精密度（批内精密度）与中间精密度（批间精密度）：连续测定5d，每天一个分析批，每批高低两个浓度水平，每一个浓度水平同一样品重复测定 3 次。如果因为质量控制程序或操作问题判断一批为失控，应剔除数据，并增加执行一个分析批；正常使用每日质控品。计算批内和批
6、间标准差。4.3.2 判定标准：批内精密度 CV%应小于 3/5 总允许误差（TEa） ；批间精密度CV%应小于 4/5 总允许误差（TEa） ；如果批内精密度、批间精密度小于允许范围的，验证通过；如果批内精密度、批间精密度大于验证值，精密度验证未通过，重新验证或与厂家联系并取得帮助。4.4 检出限是限度试验的参数，指试样中被测物能被检测出的最低量。定量分析的检出限必须经过分析适量的在检出限附近的样品或分析按检出限条件配制的样品的方法进行验证。4.4.1 验证方法：选定一份浓度接近制造商声明的检出限的样本，或采用高值样本用阴性血清进行稀释，进行 20 次独立测定。4.4.2 判断标准：阳性率应
7、95%，符合要求。4.5 定量限指样品中被测物能被定量测定的最低值，其结果应具有一定的准确度和精密度。定量分析的定量限必须经过分析适量的在定量限附近的样品或分析按定量限条件配制的样品的方法进行验证。4.5.1 验证方法：选定一份浓度在线性范围下限左右的样本，或采用高值样本用阴性血清进行稀释，进行 20 次独立测定。标题：分子生物组检测程序性能验证标准操作程序文件编号:HBHTCM/LH-SOP-PCR- 版本号： 修改号：0生效日期：- 发行部门：PCR 组编制人： 审核人：Logo/医院检验科laboratory/lab批准人： 页码：第 3 页 / 共 4 页4.5.2 判断标准：分析检测
8、结果的 SD 值0.24，符合要求。4.6 线性和测量/可报告范围：线性指在检测范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。4.6.1 验证方法：取评价项目的高、低值病人标本各一份， （高值标本为接近线性范围上限或略超过线性上限的标本，低值标本为检测阴性的标本） 。用低值标本对高值标本按 110 的比例进行倍比稀释，配制成系列浓度梯度的血清，使检出限上的点至少不得少于 5 个。每个样本标本重复测定 3 次，记录结果。所有样品应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。统计数据，剔除离群值，单个离群值可直接由数据组中剔除并进行重测，全部样本无需重新测定。如发现多个离群值或
9、数据点过于分散，需检查造成此误差的可能原因，对可能原因进行纠正后，对全部样本进行重新测定。求出 3 次测定结果的平均值和每一稀释度的预期值。以实测均值为 X，以预期值为 Y，在初步判断无离群值后，使用 EXCEL 软件进行二元一次的回归分析。4.6.2 判断方法：数据拟合为直线，所有数据几乎均落在一条直线上，相关系数0.95 为符合要求。或可依据制造商声明的标准。否则，应重新进行线性验证。4.7 测量/可报告范围测量范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。4.7.1 验证方法：同 5.6 中的线性，其线性范围即为测量范围。4.7.2 判断方法：当肝炎系列核酸检
10、测线性范围足够宽时，其范围即可成为其临床可报告范围。因为当上述验证的荧光定量 PCR 法核酸检测检测试剂盒说明书中检测程序的线性范围很宽时，高浓度已属临床高载量患者，符合抗病毒治疗指标，不必要对更高的载量进行精确检测；若结果低于检测限，已为临床疗效监测效果较好的指标，大量研究表明，此群患者对抗病毒治疗不敏感，因此对疗效监测意义不大，如果的确需要更低更准确的检测结果，则建议采用更敏感的检测方法。4.8 抗干扰能力血液样本内源产物血红蛋白、胆红素和甘油三酯会对核酸的检测结果产生干扰，导致标本溶血、黄疸及脂血时检测结果不准确。4.8.1 验证方法：采用回收试验，分别在 5 个已知分析物浓度的样品中加
11、入不同干粉或液体干扰物，达到制造商声明的干扰物浓度后进行检测、分析。标题：分子生物组检测程序性能验证标准操作程序文件编号:HBHTCM/LH-SOP-PCR- 版本号： 修改号：0生效日期：- 发行部门：PCR 组编制人： 审核人：Logo/医院检验科laboratory/lab批准人： 页码：第 4 页 / 共 4 页4.8.2 判断标准：至少 4 个样品测量结果与分析物预期浓度偏倚7.5%时，说明干扰物对分析物的检测没有干扰作用。5 相关文件5.1 HBHTCM/LH-CX-24 量值溯源管理程序5.2 HBHTCM/LH-CX-28 检验程序的选择和确认程序6 相关的记录表格和报告6.1 HBHTCM/LH-JL-TY-28-01 检测系统/ 方法的分析性能验证评估报告
