1、1说 明 书 摘 要本发明提供一种兽药的检测方法，所述方法包括如下步骤：（1）样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后经过多个步骤处理得到上清液过滤得到的滤液用于 UPLC-MS/MS 测定；（ 2）兽药残留的测定，将得到的样品在一定的测定条件下进行超高效液相色谱与质谱联用的测定。本 发 明的 检 测 方 法 具 有 灵 敏 度 高 ， 专 属 性 强 的 特 点 ， 能 够 满 足 兽 药 残 留 的 测 定 。1权 利 要 求 书 1. 一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行第
2、一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于 UPLC-MS/MS 测定；（2）兽药残留的测定将步骤（1）得到的样品进行超高效液相色谱与质谱联用的测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；源温为105-115；脱溶剂温度为340-360 ；脱溶剂气流速度为600Lh -1-700Lh-1；锥孔反吹气流速度为45 Lh-1-55Lh-1。2. 如权利要求1
3、所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素类药物、受体激动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。3. 如权利要求1或2所述的兽药残留的检测方法，其中所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间
4、甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹 噁啉中的一种、几种或全部。4. 如权利要求1-3任一项所述的兽药残留的检测方法，步骤（2）所述梯度洗脱程序为：20-10.0 min：甲醇的体积比为 3.0-90.0%；10.0-10.1min：甲醇的体积比为 90.0-3.0；10.1-13.0min：甲醇的体积比为 3.0。5. 如权利要求1-4任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述氮气吹干上清液的温度为25-35，优选在30下进行。6. 如权利要求1-5任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述第一次离心和第二次离心的转速为9000 rmin
5、 -1-11000 rmin-1，离心的时间为8 min -12min，优选所述第一次离心和第二次离心的转速为10000 rmin -1，离心的时间为10 min。7. 如权利要求1-6任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（1525）：（ 7585）；更优选两者的体积比例为10% 三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。8. 如权利要求1-7任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（1）所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进
6、行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。9. 如权利要求1-8任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（2）的甲酸水溶液的质量浓度为0.04-0.07，优选质量浓度为0.05。10. 如权利要求1-9 任一项所述的兽药残留的检测方法，其中步骤（2）所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin -1；柱温为30。质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为 3.5 KV；锥孔电压为 3.0 V；RF 透镜电压为 0.5 V；源温为 110；脱溶剂温度为 350；脱溶剂气流速度为
7、 650Lh-1；锥孔反吹气流速度为 50Lh-1。1说 明 书一种兽药残留的检测方法技术领域本发明涉及以一种检测方法，特别是涉及一种兽药残留的检测方法。背景技术兽 药 在 防 治 动 物 疾 病 、 提 高 生 产 效 率 、 改 善 畜 产 品 质 量 等 方 面 起 着 十分 重 要 的 作 用 。 然 而 ， 由 于 养 殖 人 员 对 科 学 知 识 的 缺 乏 以 及 一 味 地 追 求 经济 利 益 ， 致 使 滥 用 兽 药 现 象 在 当 前 畜 牧 业 中 普 遍 存 在 。随 着 人 们 对 动 物 源 食 品 由 需 求 型 向 质 量 型 的 转 变 ， 动 物 源
8、食 品 中 的 兽药 残 留 已 逐 渐 成 为 全 世 界 关 注 的 一 个 焦 点 。 兽 药 残 留 是 指 用 药 后 蓄 积 或 存留 于 畜 禽 机 体 或 产 品 (如 鸡 蛋 、 奶 品 、 肉 品 等 )中 原 型 药 物 或 其 代 谢 产 物 ，包 括 与 兽 药 有 关 的 杂 质 残 留 。 目 前 ， 在 动 物 源 食 品 中 较 容 易 引 起 兽 药 残 留量 超 标 的 兽 药 主 要 有 抗 生 素 类 、 磺 胺 类 和 激 素 类 等 药 物 。滥 用 兽 药 极 易 造 成 动 物 源 食 品 中 有 害 物 质 的 残 留 ， 这 对 人 体 健
9、 康 造 成直 接 危 害 。 例 如 长 期 食 用 兽 药 残 留 超 标 的 食 品 后 ， 当 体 内 蓄 积 的 药 物 浓 度达 到 一 定 量 时 人 体 会 产 生 多 种 急 慢 性 中 毒 现 象 。 目 前 ， 国 内 外 已 有 多 起 有关 人 食 用 盐 酸 克 仑 特 罗 超 标 的 猪 肺 脏 而 发 生 急 性 中 毒 事 件 的 报 道 。四 环 素 类 药 物 能 够 与 骨 骼 中 的 钙 结 合 ， 抑 制 骨 骼 和 牙 齿 的 发 育 。 磺 胺类 药 物 能 够 破 坏 人 体 造 血 机 能 等 。 另 一 方 面 ， 动 物 机 体 长 期
10、反 复 接 触 某 种抗 菌 药 物 后 ， 其 体 内 敏 感 菌 株 受 到 选 择 性 的 抑 制 ， 从 而 使 耐 药 菌 株 大 量 繁殖 ， 耐 药 性 细 菌 的 产 生 使 得 一 些 常 用 药 物 的 疗 效 下 降 甚 至 失 去 疗 效 。 此 外 ，滥 用 兽 药 对 畜 牧 业 的 发 展 和 生 态 环 境 也 造 成 极 大 危 害 。 动 物 用 药 后 ， 一 些性 质 稳 定 的 药 物 随 粪 便 、 尿 被 排 泄 到 环 境 中 后 仍 能 稳 定 存 在 ， 从 而 造 成 环境 中 的 药 物 残 留 。 长 期 滥 用 药 物 严 重 制 约
11、 着 畜 牧 业 的 健 康 持 续 发 展 。 如 长期 使 用 抗 生 素 易 造 成 畜 禽 机 体 免 疫 力 下 降 ， 影 响 疫 苗 的 接 种 效 果 ， 还 可 引起 畜 禽 内 源 性 感 染 和 二 重 感 染 。2对 动 物 性 食 品 中 的 兽 药 残 留 进 行 监 控 的 一 个 重 要 手 段 就 是 建 立 快 速 准确 的 残 留 分 析 方 法 。 目 前 ， 报 道 的 文 献 及 国 家 标 准 中 大 多 是 单 一 兽 药 或 单一 种 类 兽 药 的 检 测 方 法 ， 但 在 实 际 工 作 中 ， 由 于 动 物 性 食 品 安 全 的 保
12、 证 需要 多 个 指 标 进 行 综 合 指 证 ， 因 此 ， 单 个 样 本 常 需 要 多 次 检 测 工 作 ， 极 大 的浪 费 了 人 力 、 物 力 及 财 力 。 多 残 留 的 检 测 能 够 更 好 的 节 省 时 间 、 提 高 工 作效 率 ， 并 能 更 加 有 效 地 监 测 动 物 产 品 的 安 全 性 。 另 一 方 面 ， 国 内 外 报 道 的动 物 源 性 食 品 中 药 物 残 留 检 测 的 检 测 方 法 主 要 有 液 相 色 谱 法 （ HPLC） 、气 相 色 谱 -质 谱 联 用 法 (GC-MS)、 液 相 色 谱 -串 联 质 谱 联
13、 用 法 (LC-MS/MS)、酶 联 免 疫 法 及 生 物 传 感 器 技 术 。酶 联 免 疫 分 析 技 术 (ELISA)是 一 种 将 酶 化 学 反 应 的 敏 感 性 和 抗 原 抗 体 免疫 反 应 的 特 异 性 相 结 合 的 方 法 ， 其 敏 感 性 和 特 异 性 较 好 。 ELISA具 有 样 品前 处 理 简 单 ， 纯 化 步 骤 少 ， 大 量 样 本 分 析 时 间 短 ， 适 合 于 做 成 试 剂 盒 现 场筛 选 等 优 点 ， 使 其 可 实 现 快 速 现 场 监 测 ， 是 现 阶 段 食 品 安 全 检 测 领 域 应 用较 多 的 一 项
14、 检 测 技 术 。 但 它 也 存 在 着 很 多 缺 陷 ： 对 试 剂 的 选 择 性 高 ， 很 难同 时 分 析 多 种 成 分 ； 对 结 构 类 似 的 化 合 物 有 一 定 程 度 的 交 叉 反 应 ； 分 析 分子 量 很 小 的 化 合 物 或 很 不 稳 定 的 化 合 物 有 一 定 的 困 难 。生 物 传 感 器 是 由 一 种 生 物 敏 感 膜 和 电 化 学 转 换 器 两 部 分 配 合 ， 对 特 定种 类 的 化 学 物 质 或 生 物 活 性 物 质 具 有 选 择 性 和 可 逆 响 应 的 分 析 装 置 。 在 兽药 残 留 分 析 上 得
15、到 了 较 广 泛 的 应 用 。 虽 然 生 物 传 感 器 具 有 微 型 化 、 响 应 速度 快 、 样 品 用 量 少 的 特 点 ， 但 还 存 在 着 结 果 的 稳 定 性 、 重 现 性 和 使 用 寿 命方 面 的 问 题 。现 有 技 术 的 方 法 常 有 灵 敏 度 不 高 、 前 处 理 繁 琐 、 检 测 药 物 单 一 或 重 现性 不 好 等 问 题 ， 很 难 满 足 对 药 物 残 留 的 同 时 确 证 检 测 。液 质 联 用 （ HPLC-MS） 的 检 测 方 法 以 液 相 色 谱 作 为 分 离 系 统 ， 质 谱 为检 测 系 统 。 样 品
16、 在 质 谱 部 分 被 离 子 化 后 ， 经 质 谱 的 质 量 分 析 器 将 离 子 碎 片按 质 量 数 分 开 ， 经 检 测 器 得 到 质 谱 图 。 液 质 联 用 体 现 了 色 谱 和 质 谱 优 势 互补 ， 将 色 谱 对 复 杂 样 品 的 高 分 离 能 力 ， 与 MS具 有 高 选 择 性 、 高 灵 敏 度 及能 够 提 供 相 对 分 子 质 量 与 结 构 信 息 的 优 点 结 合 起 来 ， 在 药 物 分 析 领 域 具 有3了 广 泛 的 应 用 。 液 质 联 用 （ HPLC-MS） 分 析 样 品 中 定 性 和 定 量 方 面 的 优 势
17、是 单 独 液 相 分 析 不 能 媲 美 的 。发明内容本 发 明 解 决 的 技 术 问 题 是 ： 提 供 一 种 新 的 兽 药 残 留 的 检 测 方 法 ， 其 是通 过 液 质 联 用 的 检 测 方 法 实 现 多 种 类 多 样 品 的 检 测 。具 体 来 说 ， 本 发 明 是 通 过 如 下 技 术 方 案 实 现 的 ：一种兽药残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得
18、到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于 UPLC-MS/MS 测定；（2）兽药残留的测定将步骤（1）得到的样品进行超高效液相色谱与质谱联用的测定，测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；源温为105-115；脱溶剂温度为340-360 ；脱溶剂气流速度为600Lh -1-700Lh-1；锥孔反吹气流速度为45 Lh-1-55Lh-1。其中，所述兽药为四环素类药物、受体激动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。其中，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素
19、、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、4磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一种、几种或全部。其中，步骤（2）所述梯度洗脱程序为：0-10.0 min：甲醇的体积比为 3.0-90.0
20、%；10.0-10.1min：甲醇的体积比为 90.0A-3.0 ；10.1-13.0min：甲醇的体积比为 3.0。其中，步骤（1）所述氮气吹干上清液的温度为25-35，优选在30下进行。其中，步骤（1）所述第一次离心和第二次离心的转速为9000 rmin -1-11000 rmin-1，离心的时间为 8 min -12 min，优选所述第一次离心和第二次离心的转速为10000 rmin -1，离心的时间为 10 min。其中，步骤（1）所述提取剂为10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液；优选两者的体积比例为10%三氯乙酸水溶液：乙腈 =（1525）：（7585）；更优选两者的体积比例为10%
21、三氯乙酸水溶液：乙腈 =20：80。其中，步骤（1）所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。其中，步骤（2）的甲酸水溶液的体积浓度为0.04-0.07，优选体积浓度为0.05。其中，步骤（2）所述色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C 18柱；流动相为甲醇和甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin -1；柱温为30；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为 3.5 KV；锥孔电压为 3.0 V；RF 透镜电压为 0.5 V；
22、源温为 110；脱溶剂温度为 350；脱溶剂气流速度为 650Lh-1；锥孔反吹气流速度为 50Lh-1。本 发 明 的 有 益 技 术 效 果 如 下 ：本 发 明 的 检 测 方 法 具 有 灵 敏 度 高 ， 专 属 性 强 的 特 点 。5本 发 明 采 用 的 超 高 液 相 色 谱 进 行 测 定 ， 超 高 效 液 相 色 谱 （ Ultra Performance Liquid Chromatography 简 称 UPLC） 是 分 离 科 学 中 的 一 个 全 新类 别 ， UPLC 借 助 于 HPLC 的 理 论 及 原 理 ， 涵 盖 了 小 颗 粒 填 料 、 非
23、 常 低 系统 体 积 及 快 速 检 测 手 段 等 全 新 技 术 ， 增 加 了 分 析 的 通 量 、 灵 敏 度 及 色 谱 峰容 量 。 超 高 液 相 色 谱 在 测 定 上 相 对 于 普 通 液 相 色 谱 存 在 很 多 优 点 。 与 传 统的 HPLC 相 比 ， UPLC 的 速 度 、 灵 敏 度 及 分 离 度 分 别 是 HPLC 的 9 倍 、 3倍 及 1.7 倍 ， 它 缩 短 了 分 析 时 间 ， 同 时 减 少 了 溶 剂 用 量 降 低 了 分 析 成 本 。UPLC-MS/MS 联用技术，结合了液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵
24、敏度高、选择性强的优势，尤其是串联质谱技术 (MS/MS 或 MSn) 的应用，可以获得丰富、有效的化合物结构信息，建立快速、高效的分析研究体系。本发明的目的是克服现有技术的不足，针对4种四环素类药物、18种磺胺类药物、14种喹诺酮类药物及10种受体激动剂药物建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS) 方法，以保障对动物源性食品中该类药物残留的检测。此外，本发明为了提高分析的灵敏度和专一性，进行多时间段的多反应检测扫描（MRM）（ multi-period MRM，mpMRM），即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行MRM 扫描，并同时进
25、行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的准确性和专属性。本发明建立了稳定高效的测定方法，当待测样品通过本发明测定方法进行测定时，通过与所述的定性离子色谱图及保留时间进行残留药物的定性分析，并进一步通过定量离子色谱图和标准曲线最终确定残留药物的含量。附图说明图 1：4 种四环素类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；图 2：10 种 -受体激动剂类药物和 3 种氘代内标混合对照物的定量离子通道色谱图；图 3：14 种喹诺酮类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；6图 4 18 种磺胺类药物混合对照物的定量离子通道色谱图；上述各图是 UPLC-MS/MS 测定结果的原始图谱，由于软件系统是
26、英文的，故输出的原始图是英文的，其中 1207 代表样品的名称，图中的英文翻译如下：Channels ：质谱检测离子的通道Tetracycline： 四环素、 Oxytetracycline： 土霉素、 Chlorotetracycline： 金霉素、D oxycycline： 强力霉素；Terbutaline； 特步他林、 Cimaterol： 西马特罗、 Salbutamol： 沙丁胺醇、Salbutamol-D6： 氘代沙丁胺醇、F enoterol： 菲诺特罗、 Ractopamine： 莱克多巴胺、R actopamine-D6： 氘代莱克多巴胺、C lorprenaline： 氯丙
27、那林、Clenbuterol： 克伦特罗、 Clenbuterol-D9：氘代克伦特罗、T ulobuterol： 妥布特罗、P enbutolol： 喷布洛尔、P henyl EA A： 苯乙醇胺 A；Pefloxacin： 培氟沙星，C iprofloxacin： 环丙沙星，E nrofloxacin： 恩诺沙星，O floxacin： 氧氟沙星， Enoxacin： 伊诺沙星、P ipemidic Acid 吡哌酸、Nalidixic Acid： 萘啶酸、C inoxacin： 西诺沙星、 Norfloxacin： 诺氟沙星、Danofloxacin： 达氟沙星、L omefloxaci
28、n： 洛美沙星、D ifloxacin： 二氟沙星、Sarafloxacin： 沙氟沙星、S parfloxacin： 司帕沙星;Sulfadoxine： 磺胺邻二甲氧嘧啶、S ulfadiazine： 磺胺嘧啶、Sulfathiazole： 磺胺噻唑、S ulfapyridine： 磺胺吡啶、S ulfamerazine： 磺胺甲基嘧啶、S ulfamoxol： 磺胺二甲基噁唑、S ulfameter： 磺胺对甲氧嘧啶、Sulfamethazine： 磺胺二甲嘧啶、S ulfamethizole： 磺胺甲噻二唑、Sulfamethoxypyridazine： 磺胺甲氧哒嗪、S ulfamet
29、hoxazole： 磺胺甲噁唑、Sulfachloropyridazine： 磺胺氯达嗪、S ulfamonomethoxine： 磺胺间甲氧嘧啶、Sulfacetamide： 磺胺醋酰、 Sulfisoxazole： 磺胺二甲异噁唑、Sulfaphenazole： 磺胺苯吡唑、S ulfadimethoxine： 磺胺二甲氧嘧啶、Sulfaquinoxaline： 磺胺喹 噁啉。具 体 实 施 方 式7本发明提供了一种兽药残留的检测方法，所述方法包括如下步骤：（1）样品的处理：将待测样品进行粉碎，加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得
30、到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于 UPLC-MS/MS 测定；所述待测样品是各类动物源的肉、蛋、奶。当所述的样品为肉时，前处理的步骤是通过料理机进行粉碎；当待测样品是蛋时，去壳打碎；当待测样品是奶时，只需要简单过滤除杂就可以。所述的两次离心分离目的是使样品中蛋白质尽量全部除去，防止堵塞液相色谱柱，同时减少残留物质对测定结果的干扰。所述的提取剂为 10%三氯乙酸水溶液与乙腈的混合溶液，两者的体积比例为 10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（1525 ）：（7585），优选两者的体积比例为 10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20： 80。
31、所述的提取剂的选择是考虑到蛋白沉淀、药物溶解性及酸碱性进行选择的结果，选择单独的有机溶剂不利于小分子药物的溶解。选择酸性溶液过多会使样品中的残留药物破环，而影响测定结果的准确性。优选地，所述在第一次离心分离后得到上清液的同时得到沉淀，对沉淀进行再次提取，得到上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。优选地，所述的再次提取是将沉淀加入提取剂后进行匀浆，之后进行超声提取，之后进行离心分离得到上清液，将得到的该上清液与第一次离心分离得到的上清液进行合并，将合并后的上清液进行下一步骤的氮气吹干。所述微孔滤膜的孔径大小为 0.45 m。优选地，氮气吹干上清液的温
32、度为 25-35，优选在 30下进行。优选地，所述第一次离心和第二次离心的转速为 9000 rmin-1-11000 rmin-1，离心的时间为 8 min -12min；优选第一次离心和第二次离心的转速为10000 rmin-1，离心的时间为 10min。8通过所述的提取过程尽量地将药物提取，并保证动物内源性杂质的去除最大化，在两者同时兼顾的前提下，在本发明检测方法中提取的次数以 2 次为优选。（2）兽药残留的测定将步骤（1）得到的样品进行超高效液相色谱与质谱联用的测定；测定条件如下：色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流动相为甲醇和0.05甲酸水溶液
33、，洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.25 mLmin -1；柱温为30；进样量为10L；质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh -1；锥孔反吹气流速度为50Lh -1。优选地，所述梯度洗脱程序为：0-10.0 min：甲醇的体积比为 3.0-90.0%；10.0-10.1min：甲醇的体积比为 90.0-3.0；10.1-13.0 min：甲醇的体积比为 3.0。所述梯度洗脱的流动相配比和洗脱程序可以保证各个药物的良好分离和定量。优选地，所述兽药为四环素类药物、受体激
34、动剂类药物、喹诺酮类药物、磺胺类药物。优选地，所述兽药为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺9喹噁啉中的一种或几种或全部。所
35、述的四种兽药残用途较为广泛，在动物组织中残留较多，同时检测上述四类兽药对于食品的检测具有重要意义。上述46种药物涉及的范围很广，结构类型丰富，这说明本发明的方法可以用于多种药物的检测。在一种优选的实施方式中，本 发 明 兽 药 残 留 的 检 测 方 法 包 括 如 下 步 骤 ：（ 1） 样品前处理动物性肌肉组织首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的动物源性食品5.0 g，置于50 mL的离心管中，加入 10%三氯乙酸：乙腈提取液（V ：V=20 ：80）10.0 mL ，充分匀浆后，超声提取10 min，10 000 rmin -1 离心10 min，上清液转移到另一 50 mL
36、离心管中，残渣再用提取液10.0 mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0 mL溶解，涡旋混匀，以 10 000 rmin-1的速率高速离心10 min 。取适量上清液，0.45 m 微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。（2）样品的检测：色谱条件与质谱条件色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C 18柱 (100 mm2.1 mm，1.7m)；流动相:A相为甲醇，B相为0.05甲酸水溶液，梯度洗脱：0-10.0 min：3.0A-90.0%A ；10.0-10.1min ：90.0 A-3.0 A ；10.1-13.0 min：3
37、.0A；流速为 0.25 mLmin-1；柱温为 30；进样量为10L。电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为0.5 V；源温为110 ；脱溶剂温度为 350 ；脱溶剂气流速为650Lh -1；锥孔反吹气流速为50 Lh -1。实施例实施例 11 仪器与试药1.1 仪器Waters Ultra Performance LC 液相色谱仪(Waters 公司)，Quattro Premier XE 质谱仪 (Waters 公司)，MassLynx v 4.1 数据处理软件 (Waters 公司)；10Waters Acquity UPLC BEH
38、C18 色谱柱 (100 mm2.1 mm，1.7m) ；TranssonicTP 690 超声波清洗器（ Elma 公司）;3K15 离心机（Sigma 公司）；Millipore Elix Milli-Q 纯水仪。1.2 材料色谱纯甲醇（Fisher Scientific 公司产品）；色谱纯乙腈（Fisher Scientific公司产品）；超纯水；其他试剂均为分析纯。所用 46 种药物均是商购获得，各个药物的纯度均高于 98.0%。将健康牛肉（经过测定不含所述的46种药物中的任一种）定量加入所述的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那
39、林、克伦特罗、妥布特罗、喷布洛尔、苯乙醇胺A 、培氟沙星，环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，伊诺沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、诺氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（以下简称46种兽药），将加入兽药后牛肉加入首先用料理机充分粉碎，冷冻保存；准确称取解冻后的牛肉5.0 g，置于50 mL的离心管中，加入 10%三氯乙酸：乙腈提取液（V ：V
40、=20 ：80）10.0 mL ，充分匀浆后，超声提取10 min，10 000 rmin -1离心10 min，上清液转移到另一 50 mL离心管中，残渣再用提取液10.0 mL重复提取一次，合并提取液，将提取液于30下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0 mL 溶解，涡旋混匀，以 10 000 rmin-1的速率高速离心10 min 。取适量上清液，0.45 m 微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。2 方法与结果2.1 方法2.1.1 色谱条件色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C 18柱；流动相为甲醇和0.05甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱，A相为甲醇， B相为0
41、.05甲酸水溶液，0-1110.0 min：3.0A-90.0%A；10.0-10.1min ：90.0A-3.0 A ；10.1-13.0 min：3.0A；流速为0.25 mLmin -1；柱温为 30；进样量为10L。2.1.2质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压为3.5 KV；锥孔电压为3.0 V；RF透镜电压为 0.5 V；源温为110；脱溶剂温度为350；脱溶剂气流速度为650Lh -1；锥孔反吹气流速度为50Lh -1。2.2 质谱条件优化将所述的 46 种药物分别进行 MS 扫描，确定各个药物的定性离子和定量离子，并优化各个药物离子对的碰撞电压。为了提高分析的灵敏度和
42、专一性，选用多反应监测模式(Multi-Reaction Monitoring，MRM) 进行检测，并同时进行定性和定量的双离子通道分析，进而进一步提高该方法的定性准确性和专属性。46 种药物保留时间、定性离子对和定量离子对列于表 1。为了增强方法的灵敏度，本研究进行多时间段的多反应检测扫描，即按照待测药物的保留时间，分为多个时间段分别进行 MRM 扫描，以增加每个药物的扫描时间，进而提高灵敏度。具体来说，根据各个药物的保留时间确定监测时间，得到测定结果见表 2。表1 46种药物的保留时间、定性离子对和定量离子对药 物 保 留 时 间 定 量 离 子 对 定 性 离 子 对四 环 素 (Tet
43、racycline) 4.89 445.1410.1 445.1428.1土 霉 素 (Oxytetracycline) 5.02 461.2426.0 461.2443.1金 霉 素 (Chlorotetracycline) 6.21 479.2443.9 479.2462.3四环素类 强 力 霉 素 (Doxycycline) 7.22 445.1428.1 445.1410.1特 步 他 林 (Terbutaline) 2.95 226.0124.9 226.0151.9西 马 特 罗 ( Cimaterol) 3.13 220.0159.9 220.0202.0沙 丁 胺 醇 (Sal
44、butamol) 3.20 240.1147.9 240.1222.0菲 诺 特 罗 (Fenoterol) 3.83 304.0134.9 304.0104.9莱 克 多 巴 胺 (Ractopamine) 4.99 302.1164.0 302.1106.9氯 丙 那 林 (Clorprenaline) 5.35 214.0153.9 214.0196.0克 伦 特 罗 (Clenbuterol) 5.46 277.0202.9 277.0259.0妥 布 特 罗 (Tulobuterol) 6.02 228.0153.9 228.0171.9喷 布 洛 尔 ( Penbutolol) 9
45、.15 292.1201.0 292.1236.1受体激动剂类药物苯 乙 醇 胺 A（ Phenylethanolamine A） 7.27 345.2327.2 345.2150.0培 氟 沙 星 (Pefloxacin) 4.67 334.2316.2 334.2290.2环 丙 沙 星 (Ciprofloxacin) 4.96 332.1314.1 332.1288.1喹诺酮 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin) 4.99 360.2316.2 360.2245.112氧 氟 沙 星 （ Ofloxacin） 4.66 362.1318.1 362.1261.1伊 诺 沙 星
46、（ Enoxacin） 4.71 321.0232.1 321.0303.2吡 哌 酸 （ Pipemidic Acid） 4.23 304.0217.1 304.0189.0萘 啶 酸 （ Nalidixic Acid） 7.52 233.0215.0 233.0187.0西 诺 沙 星 （ Cinoxacin） 6.17 263.1245.1 263.1217.1诺 氟 沙 星 （ Norfloxacin） 4.85 320.0302.2 320.0276.2达 氟 沙 星 （ Danofloxacin） 5.03 358.2340.1 358.2238.1洛 美 沙 星 （ Lomefl
47、oxacin） 5.15 352.1265.1 352.1308.1二 氟 沙 星 （ Difloxacin） 5.23 400.2382.1 400.2356.1沙 氟 沙 星 （ Sarafloxacin） 5.42 386.2299.1 386.2342.2类药物司 帕 沙 星 （ Sparfloxacin） 5.87 393.1349.2 393.1292.2磺 胺 邻 二 甲 氧 嘧 啶 （ Sulfadoxine） 5.30 311.1156.0 311.1108.1磺 胺 嘧 啶 （ Sulfadiazine） 3.33 251.1156.0 251.1108.1磺 胺 噻 唑
48、（ Sulfathiazole） 3.63 256.0155.9 256.092.0磺 胺 吡 啶 （ Sulfapyridine） 3.76 250.0155.9 250.0184.0磺 胺 甲 基 嘧 啶 （ Sulfamerazine） 3.95 265.0155.9 265.0171.9磺 胺 二 甲 基 噁 唑 （ Sulfamoxol） 4.36 268.0155.9 268.0113.0磺 胺 对 甲 氧 嘧 啶 （ Sulfameter） 4.41 281.0156.0 281.0215.1磺 胺 二 甲 嘧 啶 （ Sulfamethazine） 4.48 279.0186.
49、0 279.0124.0磺 胺 甲 噻 二 唑 （ Sulfamethizole） 4.52 271.0155.9 271.092.0磺 胺 甲 氧 哒 嗪（ Sulfamethoxypyridazine） 4.71 281.0155.9 281.0108.0磺 胺 甲 噁 唑 （ Sulfamethoxazole） 5.12 254.0155.9 254.092.0磺 胺 氯 达 嗪 （ Sulfachloropyridazine） 4.99 285.0155.9 285.0108.0磺 胺 间 甲 氧 嘧 啶 （ Sulfamonomethoxine） 5.22 281.1155.9 281.1108.0磺 胺 醋 酰 （ Sulfacetamide） 2.96 215.1156.0 215.1108.1磺 胺 二 甲 异 噁 唑 （ Sulfisoxazole） 5.39 268.1156.0 268.1113.1磺 胺 苯 吡 唑 （ Sulfaphenazole） 5.97 315.1160.1 31
