1、蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 凝 胶 层 析 法一 、 实 验 目 的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。3. 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。二 、 实 验 原 理（ 一 ） 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研究热点 1 。分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等 2-4。（ 二 ） 凝 胶 层 析
2、法层析法，又称色层分析法或色谱法（Chromatography） ，在 1903-1906 年由俄国植物学家 M.Tswett 首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等方法 5。凝胶层析法（gel filtration） ，又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法 (GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等 6，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大
3、颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。由于其分离条件温和、 样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。 虽然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化达到更
4、好的效果 7。（ 三 ） 凝 胶凝 胶 是 由 胶 体 溶 液 凝 结 而 成 的 固 体 物 质 ， 其 内 部 具 有 很 微 细 的 多 孔网 状 结 构 。 常 用 的 天 然 凝 胶 是 琼 脂 糖 凝 胶 （ agarose gel， 商 品 名Sepharose） ， 人 工 合 成 凝 胶 是 葡 聚 糖 （ dextran， 商 品 名 为 SePhadex） ，凝 胶 型 号 不 同 ， 孔 隙 度 不 同 ， 但 都 不 溶 于 水 。这 种 聚 合 物 的 立 体 网 状 结 构 ， 其 孔 隙 大 小 与 被 分 离 物 质 分 子 的 大 小 有相 应 的 数 量
5、级 。 在 凝 胶 充 分 溶 胀 后 ， 交 联 度 高 的 ， 孔 隙 小 ， 只 有 相 应 的 小分 子 可 以 通 过 ， 适 于 分 离 小 分 子 物 质 。 相 反 ， 交 联 度 低 的 孔 隙 大 ， 适 于 分离 大 分 子 物 质 。 利 用 这 种 性 质 可 分 离 不 同 分 子 量 的 物 质 。（ 四 ） 测 量 方 法凝 胶 过 滤 层 析 , 是 一 种 分 离 不 同 大 小 分 子 的 分 配 层 析 , 被 分 离 物 质的 分 子 在 溶 剂 和 限 定 孔 径 的 凝 胶 固 定 相 中 被 分 配 , 混 合 物 随 流 动 相 流 经层 析
6、柱 时 , 各 种 物 质 同 时 进 行 着 垂 直 向 下 的 运 动 和 无 定 向 的 扩 散 运 动 , 混 合 物 中 各 物 质 因 相 对 分 子 质 量 的 大 小 不 同 而 被 分 离 , 这 种 方 法 操 作 简便 , 费 用 较 低 , 重 复 性 好 8。 因 其 能 像 筛 子 一 样 筛 分 不 同 大 小 的 分 子 ，因 此 又 称 为 “分 子 筛 ”。 其 具 有 许 多 良 好 的 性 能 ， 因 此 在 蛋 白 质 的 分 离 分析 中 被 广 泛 采 用 。 经 过 不 少 人 的 实 际 应 用 和 完 善 ， 该 方 法 已 经 变 成 一
7、种可 靠 的 测 定 高 分 子 分 子 量 的 方 法 9。将 凝 胶 装 柱 后 ， 柱 床 体 积 称 为 “总 体 积 ”， 以 Vt（ total volume）表 示 。 Vt 由 三 部 分 组 成 ， 即 Vt=Vo+Vi+Vg。 Vo 称 为 “孔 隙 体 积 ”或 “外体 积 ”（ outer volume） 又 称 “外 水 体 积 ”， 即 存 在 于 柱 床 内 凝 胶 颗 粒 外 面空 隙 之 间 的 水 相 体 积 ， 相 当 于 一 般 层 析 法 中 柱 内 流 动 相 的 体 积 ； Vi 为 内体 积 （ inner volume） ， 又 称 “内 水
8、体 积 ”， 即 凝 胶 颗 粒 内 部 所 含 水 相 的 体积 ， 相 当 于 一 般 层 析 法 中 的 固 定 相 的 体 积 ， 它 可 从 干 凝 胶 颗 粒 重 量 和 吸 水后 的 重 量 求 得 ； Vg 为 凝 胶 本 身 的 体 积 。而 洗 脱 体 积 （ Ve， elution Volume） 与 Vo 及 Vi 之 间 的 关 系 为 ： Ve=Vo+KdViVe 是 自 加 入 样 品 时 起 ， 到 组 分 最 大 浓 度 （ 峰 ） 出 现 时 所 流 出 的 体 积 ； 本实 验 凝 胶 层 析 柱 中 填 充 的 是 交 联 葡 聚 糖 ， 含 有 蛋 白
9、 的 溶 液 通 过 管 柱 时 ，大 分 子 的 蛋 白 呈 正 态 分 布 连 续 首 先 流 出 ， 会 形 成 一 个 蛋 白 峰 10。 Kd 为 样品 组 分 在 二 相 间 的 分 配 系 数 ， 也 可 以 说 Kd 是 分 子 量 不 同 的 溶 质 在 凝 胶 内部 和 外 部 的 分 配 系 数 ， 只 与 被 分 离 物 质 分 子 的 大 小 和 凝 胶 颗 粒 孔 隙 的 大 小分 布 有 关 ， 而 与 柱 的 长 短 粗 细 无 关 。 Kd 可 通 过 实 验 求 得 ： Kd=（ Ve- Vo） /Vi上 式 中 Ve 为 实 际 测 得 的 洗 脱 体 积
10、 ； Vo 可 用 不 被 凝 胶 滞 留 的 大 分 子 物质 的 溶 液 （ 带 颜 色 为 佳 ， 便 于 观 察 ， 如 血 红 蛋 白 、 印 度 黑 墨 水 等 ， 分 子量 约 200 万 的 蓝 色 葡 聚 糖 -2000 等 ） 通 过 实 际 测 量 求 出 ； Vi 可 由 gWR求 得 （ g 为 干 凝 胶 重 ， 单 位 为 克 ； WR 为 凝 胶 的 “吸 水 量 ”， 以 毫 升 /克 表示 ） 。 因 此 ， 对 一 层 析 柱 凝 胶 床 来 说 ， 只 要 通 过 实 验 得 知 某 一 物 质 的 洗 脱 体积 Ve， 就 可 算 出 它 的 Kd 值
11、 。三 、 实 验 器 材1 试 剂（ 1） 标 准 蛋 白 质 ： 蓝 色 葡 聚 糖 -2000（ 200KD） ， 牛 血 清 清 蛋 白（ 67KD） ， 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 （ 24.5KD） ， CytC（ 13.7KD） ， 均 为 分 析 纯 。 （ 2） 洗 脱 液 ： 0.2mol/L Tris-HCl-KCl,pH7.5取 0.5M KCl 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1M HCl40.3ml,再 加 H2O 定 容至 100ml（ 3） Sephadex G-752.器 材（ 1） 层 析 柱 ： 柱 管 1.250cm（ 2） 紫 外 分 光
12、光 度 计（ 3） 部 分 收 集 器（ 4） 刻 度 试 管四 、 实 验 步 骤1.凝 胶 的 选 择 与 处 理 ： 本 实 验 使 用 Sephadex G-75 凝 胶 。 商 品 凝 胶一 般 是 干 燥 的 颗 粒 ， 使 用 前 需 在 欲 使 用 的 洗 脱 液 中 充 分 溶 胀 。 即 在 沸 水 浴中 ， 将 悬 浮 于 洗 脱 液 中 的 凝 胶 浆 逐 渐 升 温 至 近 沸 ， 一 般 1 2h 即 可 完 成11。 根 据 层 析 柱 的 体 积 和 所 选 用 的 凝 胶 ， 膨 胀 后 床 体 积 计 算 所 需 凝 胶 干 粉的 重 量 ， 然 后 倾 入
13、 过 量 的 洗 脱 液 中 ， 室 温 吸 水 膨 胀 。 凝 胶 颗 粒 最 好 大 小均 匀 ， 这 样 流 速 稳 定 ， 结 果 较 好 。2.装 柱 ： 本 实 验 所 用 层 析 柱 的 规 格 为 1.250cm。（ 1） 将 层 析 柱 垂 直 装 好 ， 在 柱 内 先 注 入 1/4 1/5 的 水 ， 出 口 处 接 上 一根 长 约 1.5m， 直 径 2 细 塑 管 ， 塑 管 另 一 端 固 定 在 柱 的 上 端 约 45 处 。然 后 打 开 机 器 ， 排 出 气 泡 。（ 2） 随 着 下 面 水 的 流 出 ， 上 面 不 断 加 凝 胶 ， 使 形 成
14、 的 凝 胶 床 面 上 有 凝 胶 的连 续 下 降 。（ 3） 当 凝 胶 沉 积 到 柱 的 顶 端 约 6 处 ， 可 停 止 装 柱 。 （ 4） 用 眼 睛 观 察 柱 内 凝 胶 是 否 均 匀 ， 有 否 “纹 路 ”或 气 泡 。 若 层 析 柱 不均 一 ， 必 须 重 新 装 柱 。3.加 样 ： 加 样 之 前 先 吸 去 柱 管 内 的 上 清 液 ， 然 后 加 样 。 等 到 所 加 的 样与 凝 胶 界 面 相 平 时 ， 连 接 恒 压 瓶 、 层 析 柱 、 部 分 收 集 器 等 装 置 。4.洗 脱 ： 待 上 述 工 作 做 好 之 后 ， 开 始 洗
15、 脱 。 洗 脱 时 应 严 格 控 制 流 速 ，以 34 分 钟 收 集 3ml 液 体 为 宜 。 然 后 用 部 分 收 集 器 按 每 管 3mL 收 集 洗 脱流 出 液 ， 各 收 集 管 于 280nm 处 检 测 A280 值 。5.洗 脱 曲 线 、 标 准 曲 线 的 制 定（ 1） 按 上 述 步 骤 依 次 加 入 蓝 色 葡 聚 糖 -2000（ 200KD） 、 牛 血 清 清 蛋 白（ 67KD） 、 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 （ 24.5KD） 和 CytC（ 13.7KD） ， 然 后 用 50 mmol/l 的 KH2PO4-K2HPO4 缓 冲 液 溶
16、 液 洗 脱 。 待 上 一 个 样 品 在 管 柱 中 行 进约 1/3 时 再 加 下 一 个 样 。 用 部 分 收 集 器 收 集 流 出 液 体 ， 然 后 用 紫 外 分 光光 度 计 于 280nm 处 测 定 每 管 A 值 ， 以 管 号 或 者 洗 脱 体 积 为 横 坐 标 ， A 值为 纵 坐 标 绘 出 洗 脱 曲 线 。根 据 洗 脱 峰 位 置 量 出 每 种 蛋 白 质 的 洗 脱 体 积 Ve。 然 后 以 蛋 白 质 分 子量 的 对 数 （ 1gM） 为 横 坐 标 ， Ve 为 纵 坐 标 ， 作 出 标 准 曲 线 。 为 了 结 果 可靠 ， 应 以
17、 同 样 条 件 重 复 1-2 次 ， 取 Ve 的 平 均 值 作 图 。五 、 实 验 结 果1. 洗 脱 曲 线 ： 本 实 验 共 依 次 加 入 4 种 分 子 量 已 知 的 蛋 白 质 ， 分 别 为 A:蓝 色葡 聚 糖 -2000（ 200KD） 、 B:牛 血 清 清 蛋 白 （ 67KD） 、 C:胰 凝 乳 蛋 白 酶 原（ 24.5KD） 和 D:CytC（ 13.7KD） 。每 34 分 钟 收 集 3ml 液 体 为 一 管 ， 共 收 集 了 25 管 ， 每 管 在 280nm处 测 得 的 吸 光 度 值 A 值 （ 即 OD 值 ） 见 表 1：表 1：
18、 每 管 洗 脱 液 对 应 的 OD 值管号 1 2 3 4 5OD 值 0.02 0.037 0.041 0.318 0.14管号 6 7 8 9 10OD 值 0.036 0.006 0.326 0.089 0.053管号 11 12 13 14 15OD 值 0.019 0.024 0.06 0.286 0.344管号 16 17 18 19 20OD 值 0.22 0.078 0.031 0.024 0.105管号 21 22 23 24 25OD 值 0.184 0.134 0.091 0.047 0.023因 此 ， 以 管 号 为 横 坐 标 ， OD 值 为 纵 坐 标 绘
19、制 的 洗 脱 曲 线 见 图 1：由 表 1 算 得 4 种 样 品 的 洗 脱 体 积 分 别 为 :Ve(A:蓝 色 葡 聚 糖 )=(3+0.5)3=10.5mlVe(B:牛 血 清 清 蛋 白 ） =(8-3-0.5)3=13.5mlVe(C:胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 ） =(15-7-0.5)3=22.5mlVe(D:CytC)=(21-11-0.5)3=28.5ml2. 标 准 曲 线 ： 以 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 （ 1gM） 为 横 坐 标 ， Ve 为 纵 坐 标 ，作 出 标 准 曲 线 。表 2:各 样 品 洗 脱 体 积 和 lgM 值样品 M lgM
20、 VeA 200000 5.301 10.5B 67000 4.826 13.5C 24500 4.351 22.5D 13700 3.876 28.50 5 10 15 20 25 3000.050.10.150.20.250.30.350.4图1 洗 脱 曲 线0.318 0.3260.3440.184OD值管 号图 1： 加 入 的 4 种 分 子 量 已 知 的 蛋 白 质 的 洗 脱 曲 线 ， 由 上 图 可 知 ：分 别 在 第 4、 8、 15 和 21 管 时 出 现 峰 值 。图 2： 加 入 的 4 种 分 子 量 已 知 的 蛋 白 质 的 标 准 曲 线六 、 分 析
21、 讨 论蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 早已成为生命科学领域的研究热点。而分子量是蛋白质的主要特征参数之一,故准确测定其分子量意义重大。凝 胶 层 析 法 在 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 方 面 ， 虽 然 不 及 聚 丙 烯 酰 氨 凝 胶 电泳 的 灵 敏 度 及 准 确 度 高 ， 但 因 其 操 作 简 便 、 试 剂 价 格 较 为 便 宜 等 优 势 而受 到 人 们 欢 迎 。影 响 分 子 量 测 定 准 确 性 的 因 素 众 多 ， 有 一 定 的 局 限 性 。 如 缓 冲 液 的pH 值 、 凝 胶 的 型 号 、 加 样 时 间 间 隔 、 顺 序 ，
22、 以 及 收 集 洗 脱 液 的 操 作 等 等都 会 对 实 验 结 果 产 生 影 响 。缓 冲 液 的 pH 值 在 6-8 时 ， 所 得 的 标 准 曲 线 的 线 性 较 为 良 好 ， 本 实 验所 用 的 缓 冲 液 的 pH 值 为 7.5， 在 该 范 围 之 内 ， 故 在 其 他 操 作 良 好 的 情 况 下所 得 的 线 性 较 为 良 好 。凝 胶 的 型 号 对 分 离 的 准 确 性 产 生 影 响 。 比 如 Sephadex G-100 和Sephadex G-50 葡 聚 糖 凝 胶 柱 , 前 者 可 在 前 期 去 除 相 对 分 子 质 量 较 大
23、 的 杂蛋 白 ， 而 后 者 的 分 离 范 围 只 有 1000-30000。 我 们 的 目 标 蛋 白 相 对 分 子 质 量 在 10000-200000 左 右 , 故 用 Sephadex G-100 或 者 Sephadex G-75 可 得 到 较 好 的 分 辨 率 。加 样 时 间 间 隔 、 顺 序 对 结 果 准 确 性 的 影 响 。 本 实 验 采 取 加 入 单 一 样品 的 方 法 ， 按 分 子 量 由 大 到 小 加 入 ， 并 且 待 上 一 个 样 品 基 本 上 快 要 走 出 柱管 时 才 加 下 一 个 样 。 分 子 量 大 的 样 品 不 能
24、 进 入 凝 胶 内 部 ， 在 凝 胶 颗 粒 之 间的 缝 隙 流 出 ， 因 此 速 度 最 快 。 从 大 到 小 加 样 ， 可 以 保 证 前 一 个 样 品 基 本 上被 分 离 出 来 ， 确 保 了 会 出 现 峰 值 ， 能 得 出 较 为 准 确 的 洗 脱 体 积 。分 光 光 度 计 使 用 波 长 为 280nm 时 ， 是 蛋 白 和 酚 类 物 质 最 高 吸 收 峰 的吸 收 波 长 ， 260nm 是 核 酸 最 高 吸 收 峰 的 吸 收 波 长 。 故 本 实 验 测 定 蛋 白 质的 分 子 量 使 用 280nm。七 、 注 意 事 项1. 加 样
25、时 按 分 子 量 由 大 到 小 加 入 ， 以 便 于 出 现 峰 值 和 计 算 洗 脱 体 积 。2. 洗 脱 液 的 pH 值 应 在 6-8 得 范 围 内 ， 以 保 证 标 准 曲 线 的 良 好 线 性 。3. 加 样 之 前 应 赶 出 管 柱 内 的 气 泡 ， 并 在 整 个 操 作 过 程 中 都 要 保 证 不 产 生气 泡 ， 否 则 洗 脱 速 度 很 慢 并 且 结 果 也 不 准 确 。4. 收 集 洗 脱 液 的 速 度 应 严 格 控 制 在 每 34 分 钟 收 集 一 管 液 体 （ 约 3m） 。5. 分 光 光 度 计 使 用 波 长 为 280
26、nm。6. 实 验 结 束 ， 及 时 清 洗 整 理 实 验 用 品 ， 经 指 导 老 师 同 意 后 才 能 离 开 实 验室 。参 考 文 献 ：1 石磊， 季怡萍，蛋白质分子量测定过程中的酸效应J.分析化学，2002（8）：9389412孔毅，吴梧桐，吴如金，蛋白质分子量测定方法比较研究J.分析仪器，2003（2）：44463王雅, 蛋白质测定实验的研究J.实验室研究与探索,2005(4):58594 王玉贤, 相玉红, 强洪, 仪器法测定蛋白质的实验研究J.实验技术与管理,2006(6):31325 Fenn JB,Mann M, Meng CK, Wong SF,Whitehou
27、se CM，Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomoleculesJ. Science, 1 989,246( 4926)：64716黄明智，明胶化学基础讲座凝胶层析法J.明胶科学与技术，1982（3）：1481547于志鹏，赵文竹，于一丁，刘静波，蛋清蛋白降压肽纯化及分子量测定J.食品工业科技，2010，7（31）：2302328张勇,吴建伟,顾莉娟，凝胶层析法分离家蝇幼虫血淋巴中抗真菌肽的研究J. 中国媒介生物学及控制杂志，2007，18（3）：2002049鲁子贤，凝胶过滤法测定蛋白质的分子量J.生物化学与生物物理进展，1974（1）：4248 10王娜娜，姚秀清，凝胶层析法测定蛋白含量的方法J.应用化工，2011,40（5）：90690811鲁战会,李里特,张泽俊，凝胶层析法及其在米面类制品研究开发中的应用J.食品科学，2004（25）：145148
