1、植物生长物质 油菜素内酯(Brassinolide, BR),植物生长物质(plant growth substances)是指植物激素、植物生长调节剂和植物体内其它能调节植物生长发育的微量有机物。 植物激素(plant hormones)是指在植物体合成的、通常从合成部位运往作用部位、对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物。 植物生长调节剂(plant growth regulators)。即凡是外用的，在微量条件下对植物的生长发育具有调节控制的有机物叫植物生长调节剂。,油菜素内酯的发现,1970年，美国学者Mitchell等报道从油菜花粉中分离出一种具有强生理活性物质，称为油菜素(B
2、rassins)，它能显著地促进豆苗的生长。 1979年美国学者Grove等在Nature上发表论文，证明了油菜素是一种混合物，精制后得到具高活性的结晶物，经仪器分析，该活性物质属于甾醇内酯，故命名为油菜素内酯(Brassinolide, BR)。以前有人分别将Brassins译成芸苔素，把Brassinolide译成芸苔素内酯 1979年，Thompson等首次成功地合成两种BR类似物。1980年Fang、池川分别报道成功地进行了BR的人工合成。,油菜素内酯的发现,科学家又从许多植物中分离的多种油菜素内酯类似物（brassinosteroid），目前已知的天然油菜素内酯类化合物有60余种（F
3、ujioka and Sakurai, 1997）。 1998年第十三届国际植物生长物质年会上被正式确认为第六类植物激素。,证实了在高等植物中，普遍存在着一大类以甾醇(Stereid)为骨架的天然甾体类生理活性物质。 甾体化合物也叫类固醇化合物，是广泛存在于动植物界的一类天然产物，如胆固醇、维生素D、胆酸、肾上腺皮质激素、强心苷等即是其化表。这一类化合物的特点是，它们都含有一个由四个环组成的环戊烷多氢菲的骨架。,油菜素内酯的研究历程 (The history of research about BR),美国马利兰州贝尔茨维尔(Beltsville)美国农业部(USDA)农业研究中心农学家Mit
4、chell领导下的四人小组，自1970年开始花粉激素的研究。他们认为，植物的花粉中一定会有高含量的植物激素。 筛选了约60种花粉，发现其中半数可促进菜豆幼苗的生长。其中以油菜和赤杨的花粉的作用为最强。这两种花粉的提取物有一个共同的特点：用高浓度处理豆苗时，由于生长过快，使第二节间茎裂，然后又重新长在一起。因此，可用菜豆幼苗的第二节间的伸长试验来进行活性测定。,Mitchell等用乙醚萃取油菜花粉的活性物质。萃取物经薄板层析，以苯-甲醇-乙酸(4584)为展开剂，发现在Rf0.350.45处有活性，取下此活性部分，用无水乙醇萃取数次，再用乙醚提取，风干后的物质，在当时(1970年)被命名为油菜素
5、。 经核磁共振谱(NMR)分析，显示有脂肪酸酯的特征信号，表明它们具有甘油酯型的结构。 从19701972年他们连续发表了四篇论文。在此期间，他们把研究重点放在生理活性上，较少注意化学结构的研究。,Mandava等发表了从油菜素提纯得到单一的物质及其结构测定的论文。他们将油菜素复合物经活性硅酸镁(Florisil)柱层析，其乙醚甲醇(11)的洗脱液为主要活性组分，它在硅胶薄板上为单一点。经仪器分析，得知该物质是由脂肪酸和葡萄糖所组成的酯类化合物。 这些酯类经菜豆的第二节间伸长试验，结果活性很低。他们估计，真正的活性物质，其含量大概是极微量的，必须从大量的花粉中才能获得高活性的物质。经过大量的工
6、作。终于从227千克油菜花粉中得到10毫克的高活性的结晶物，于1978年测定其结构为甾醇内酯化合物，并把油菜素改名为油菜素内酯。,油菜素内酯的分离、提纯方法 (The separation and purification of BR),将油菜花粉用去离子水洗涤30分钟(每克花粉用4毫升水)，然后过滤，重复洗涤七次。将花粉滤饼进行冷冻干燥，使含水量1%；再用异丙醇回流萃取1小时(每克花粉用3毫克异丙醇)，并用豆苗第二节间伸长法测定其活性，直到萃取液的活性很低为止。 将萃取液进行真空浓缩，则得花粉提取物；再用四氯化碳/甲醇-水溶液进行逆流分配萃取，分取上层液(即甲醇水溶液)进行真空浓缩。,再将浓
7、缩物通过两次硅胶柱层析，分别用苯甲醇乙酸(90168)及甲醇氯仿(甲醇浓度1020%)进行洗脱，用紫外光于400nm进行跟踪，收集有活性的洗脱液，浓缩后即得油菜素。 上述获得的油菜素尚含有植物脂质，必须用高效液相色谱仪(Bondapak C18，甲醇水，6535)进行精制，用菜豆第二节间伸长法测定其活性。通过上述方法，可从40千克花粉中获得4毫克的油菜素内酯。,再用甲醇重结晶，可得结晶的油菜素内酯，熔点274275，分子式C28H48O6。经质谱、红外及X射线晶体分析油菜素内酯的立体结构式。 它的化学名称是2，3，22，23-4羟基-24甲基-B-同型-7-氧-5-胆甾烯-6酮。 BRs的基本
8、结构都是胆甾烯的衍生物，它有一个甾体核，在核的C-17上有一个侧链。 根据在B环中含氧的功能团的性质，可将BRs分为3类，即内酯型、酮型和脱氧型(还原型)。,2，3，22，23-4羟基-24甲基-B-同型-7-氧-5-胆甾烯-6酮,油菜素内酯（BR1）结构,Mandava和Yokota曾对BRs的结构与活性的关系进行过讨论。基于用5种生物试法对天然的和合成的BRs类似物的测定结果，总结出结构与活性的主要关系； (1)根据B环中含氧功能团的差异，BRs活性的次序是内酯型酮型脱氧型，C-6上缺少酮没有活性； (2)在内酯型和酮型BRs中，C-24上取代基团与活性的关系是，甲基乙基H，C24上有亚甲
9、基或亚乙基也有活性； (3)C-22，C-23，C-24上具有-取向基团的化合物比取向的活性更高； (4)无论用任何检测系统，在已知的天然的和合成的BRs中，油菜素内酯是BRs中活性最高的化合物。,油菜素内酯用碱处理时，其活性丧失；若再用酸处理，则活性可恢复，这与B环内酯结构的破坏与形成有关。可见内酯环是活性表现的重要结构因素。 油菜素内酯的一些结构特点与昆虫的蜕皮激素很相似，前者的2，3-顺二醇是型，而后者则是型；蜕皮激素具有7-烯-6-酮(B环)结构，而油菜素内酯则具有B环内酯结构，这在天然甾体中是没有行先例的。,油菜素甾体的种类及其分布 (The types of BRs and the
10、ir distribution),双子叶植物(油菜、白菜、栗、茶、扁豆、菜豆、蚊母树、牵牛花)，单子叶植物(香蒲、玉米、水稻)，裸子植物(黑松、云杉)。油菜素甾体类在高等植物中是普遍存在的。 从分布的器官看，涉及到花粉、雌蕊、果实、种子、根、茎、叶等。 以花粉和种子中含量最高，每千克含11000ng，苗1100ng/kg，果实110ng/kg，叶110ng/kg，说明尽管BRs存在于几乎所有植物器官中，花粉仍是其最丰富的来源。,含量以7级表示: 1(lng/kg), 2(110ng/kg, 3(10102ng/kg), 4(102103ng/kg), 5(103104ng/kg), 6(104
11、105ng/kg) 7(105106ng/kg)。ND：不能检出。可鉴定但不能定量。空栏：是否存在尚未查明。,含量以7级表示: 1(lng/kg), 2(110ng/kg, 3(10102ng/kg), 4(102103ng/kg), 5(103104ng/kg), 6(104105ng/kg) 7(105106ng/kg)。ND：不能检出。可鉴定但不能定量。空栏：是否存在尚未查明。,含量以7级表示: 1(lng/kg), 2(110ng/kg, 3(10102ng/kg), 4(102103ng/kg), 5(103104ng/kg), 6(104105ng/kg) 7(105106ng/k
12、g)。ND：不能检出。可鉴定但不能定量。空栏：是否存在尚未查明。,Steroidal Plant Hormones 油菜素内酯 Brassinosteroids,油菜素内酯的化学结构,表42 Assignment of BR numbers to brassinosteriods,表42 Assignment of BR numbers to brassinosteriods,油菜素内酯的生物合成,油菜素内酯的生理效应 (The physiological effects of BR),油菜素内酯能促进菜豆细胞的伸长和分裂，对水稻苗显示出特别的生理效应，可使第二叶片弯曲。许多生理特性和已知的植
13、物激素有明显的差别。,油菜素内酯的生物测定,对豆苗生长的促进作用,Mitchell等用油菜素与羊毛脂混合，涂在菜豆幼苗的第二节间，发现能使节间伸长，一般在处理后48小时即可观察到；有时24小时后即已伸长。同时能使其上部显著地肥大(显著地促进细胞的分裂)；处理后，上部的未成熟部分(第三节间及顶芽)和下部的成熟部分(第一节间)也有增长，显示出油菜素可以向上、下运转。Grove等用油菜素内酯做试验，以每株1毫微克的剂量处理菜豆第二节间，结果伸长增加20%；若浓度增加至10毫微克/株以上，第二节间上部则发生弯曲、膨胀，并出现节间分裂的奇特现象。用赤霉素处理菜豆，只对节间的伸长有显著的促进作用；用油菜素
14、内酯却具有促进细胞的伸长和分裂的双重作用，这种独特的生理活性是已知植物激素少有的。Michell等还发现，油菜素可促进整株的生长。他们仍以菜豆幼苗为材料，用油菜素处理第二节间后，在数天内可使节间增长；几星期后，即可促进全株的生长，包括株高、株重、荚重、芽数等均比对照组显著增加。,油菜素对菜豆幼苗整株生长和结实的影响,*和*分别表示5%和1%的显著差别。,对水稻第二叶片的弯曲作用,丸茂等采用稻苗第二叶片倾斜法，测定油菜素内酯及其类似物的生物活性。具体方法如下：取在暗室于30培养的7天水稻幼苗(品种：金南风)，以第二叶片基部为中心，切取含叶片及叶鞘长各一厘米的切段，在恒温(30)暗室中，用蒸馏水浸
15、渍24小时。在样品瓶内放入一定量的药液，加入2.5mM的马来酸钾的水溶液1毫升，再加入10枚上述稻苗切段，置于30暗室中培育48小时后，取出切段，用量角器测量叶片与叶鞘之间的倾斜角度。,对照组叶片的倾斜角度约90。吲哚乙酸(IAA)在浓度为50g/ml时约120。油菜素内酯在0.001g/ml及0.005g/ml的低浓度分别为150。及140。当浓度在0.005g/ml以上时，其倾斜角度更大，其叶片的背轴一侧接近叶鞘。而赤霉素的浓度高达100g/ml时，仅呈微弱的活性。因此，该法具有相当高的灵敏度，可作为油菜素内酯及其类似物的生物活性测定法。,对木本植物生长的影响,以桦树，榆树及野生酸苹果树的
16、幼苗为材料，将油菜素与羊毛脂的混合物处理节间，47天后测量其生长情况，结果三种树苗的株高均比对照组增加，平均增长为对照组的两倍。 处理榆树，十个星期后，节间增加12%，叶数增加14%；处理四个月后，植株有72%的互生叶，而对照组只有29%(叶片由对生转变为互生，可作为榆树成熟的表征)，显示出油菜素可使榆树提早成熟。,光对油菜素内酯处理效果的影响,以菜豆幼苗为材料，用两种光：强光照和弱光照。处理24小时后，处理的节间长度与结照相比就有显著的差异。但在不同光照下，处理节间的生长也有很大的差别：在强光照下，节间的增长在第4天已达到高水平，其长度为对照组的5倍；在弱光照下，第5天的长度已达到对照组的1
17、0倍，节间的增长可延续到第10天。 无论在强光照下或弱光照下，处理节间的直径均比对照组大。在弱光照下，处理节间的筛管和皮层组织细胞增大很多；而在强光照下，髓部细胞增加分裂。因此，在弱光照下，节间的增长是由于细胞的伸长，而茎的加粗，则是由于细胞变大，而不是增加细胞的分裂。但在强光照下，由于细胞的分裂而造成节间直径的增加和部分的伸长，细胞只稍微变大一些。,油菜素内酯对生长的促进与“酸生长理论”,Cerana等和Romani等发现油菜素内酯对赤豆(Azukibean)上胚轴节段和玉米根尖切段生长的促进和IAA一样，是同H+分泌的增加和转移膜电位的早期过极化联系在一起的。也即共同遵循“酸生长”的理论通
18、过促进膜质子泵对H+的泵出，导致自由空间的酸化，使细胞壁松弛，进而促进生长。 但BR与IAA在其最适浓度下同时使用具有明显的加成效果，又表明它们在最初的作用方式上是有区别的 BR促进小麦胚芽鞘伸长的生理活性大于IAA。但高浓度的促进作用不如IAA明显。BR和IAA混合处理对芽鞘切段的伸长，乙烯释放和H+分泌都表现了加成作用。BR有拮抗ABA对小麦胚芽鞘切段伸长的抑制作用。,BR调节光合产物的分配,BR在菜豆试验中，幼苗地上部干物重的分配是：处理节间干重增加4%，处理部分以下节间干重增加1116%，处理节间以上部分干重减少1520%，侧枝干重也有明显增加。,BR的生长反应因植物种类而异。 BR对
19、小麦的茎叶伸长生长无促进作用，对大豆上胚轴、叶柄具有明显的生长促进作用，但对叶的扩大生长却稍有抑制。 在各种植物的BR根部浸渍试验中，发现其生长反应的敏感性按十字花科、茄科、葫芦科、豆科、旋花科、伞形科、菊科、百合科、禾本科的顺序而减弱。,表油菜素内酯对绿豆下胚轴切段有“保幼延衰”的作用。 表油菜素内酯处理促进黄瓜下胚轴的伸长，且其过氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性都十分明显地低于IAA处理及对照的样品。 BR对黄瓜子叶硝酸还原酶(NR)活性有明显提高作用。 能增强植物在某些不良环境条件下的抗性，并将其称为“逆境环境缓和激素”。,对绿豆下胚轴的脯氨酸含量增加有明显作用，从而增强对水分胁迫的抵抗力，
20、并降低绿豆下胚轴切段的电导率，维持较完整的膜结构。 参与了组织生长过程的转录和复制，从而促进RNA聚合酶活性，降低RNA、DNA水解酶活性，造成RNA和DNA的累积，促进组织的生长。 用RNA合成抑制剂放线菌素D和蛋白合成抑制剂环己亚胺等检测BRs诱导的上胚轴生长作用，表明BRs诱导生长的效应依赖于核酸和蛋白质合成。,BRs可促进欧洲甜樱桃、山茶和烟草花粉管的生长。 BR可诱导雌雄同株异花的西葫芦雄花序开出两性花或雌花。但对非诱导条件下的短日植物白苏的开花则没有作用；对未春化的萝卜的开花稍有促进作用(非严格春化种)，对春化的萝卜的开花则没有作用。BRs促进座果率的报告也颇多。,油菜素内酯与已知
21、植物激素的关系 (The relationship between BR and other hormones),1970年 Mitchell等发表油菜素的第一篇论文时，就认为它是属于一类新型植物激素。1973年Milborrow批评Mitchell等人的结论过于武断，认为当时所发表的资料并不能排除是由其他植物激素(生长素、赤霉素等)所引起的可能。因此，美国农业部研究人员分别研究了油菜素与已知激素之间的关系，并发表了一系列的文章。,生长素：Yopp等用十种生长素生物活性测定法，来考察油菜素与生长素作用的异同。 油菜素处理呈正反应的生长素生物测定法有：胡瓜下胚轴生长法；豌豆上胚轴(弯钩部位)生长
22、法；菊芋(Helianthus tuberosrs)展开法；小麦及燕麦胚芽鞘生长法。 油菜素处理呈负反应的生长素生物测定法有：豌豆撕裂茎的弯曲生长法；绿豆发根法。,Yopp等在另一篇论文中，详细讨论了油菜素与生长素及赤霉素的关系。他们用切离的菜豆下胚轴弯钩进行系统研究，其中弯钩的张开是由生长素控制的，而下胚轴的伸长则是赤霉素控制的。在暗处，油菜素处理能使弯钩关闭，而且在红光下，可延迟弯钩张开。这些效果与生长素的作用相似。产生生长素的器官(上胚轴与子叶)添加TIBA(2，3，5三碘苯甲酸，一种生长素运转的抑制剂)或IAA，均可增强油菜素的处理效果。若用PCIB(对氯苯氯异乙酸，一种抗生长素药剂)
23、处理，则可抑制油菜素所引起的弯钩关闭。他们认为，在这个体系中，油菜素可能是影响内源生长素的含量。,Steffenz等也报告，在生长素(1pmol)存在下，油菜素(0.25g)能使豆苗节段增长四倍。因此，他们认为油菜素是生长素的增效剂。 上述考察的结果显示油菜素的作用机理与生长素不尽相同，但二者可能存在着协同作用关系，在青萍和黄化西葫芦下胚轴的研究中均发现BR处理可增加内源IAA的含量。,细胞分裂素：Yopp等利用四种细胞分裂素生物测定法来研究油菜素的生理作用。 油菜素处理呈正反应的细胞分裂素生物测定法有：子叶展开法；大豆愈伤组织生长法。 油菜素处理表现负反应的细胞分裂素生物测定法有：老化延迟法
24、(苍耳、李及酸模)；黑暗中，苋亭(amarathin)色素的产生。 此外，细胞分裂素处理的结果，不会引起类似于油菜素内酯对菜豆幼苗第二节间的生长效果。因此，油菜素内酯与细胞分裂素的相互关系并不密切。,赤霉素(GA)：油菜素与GA都能使节间伸长。但是，用GA处理的节间比对照的细，而用油菜素处理的节间却较粗。GA只引起细胞变大；而油菜素处理的却具有双重(伸长和分裂)反应。 Yopp等用十一种方法来比较油菜素和GA的作用。用油菜素处理呈正反应的赤霉素生物测定法有：下胚轴生长法(菜豆、胡瓜或番茄)；整株矮型豌豆测定法；豌豆上胚轴生长法；延缓-花青甙(betacyarin)形成法。 用油菜素处理呈负反应
25、的赤霉素生物测定法有：矮型玉米测定法；-淀粉酶合成法；莴苣下胚轴生长法；莴苣发芽法。,Yopp等用切离的菜豆下胚轴弯钩为材料，系统研究油菜素与GA之间的关系。油菜素和GA均可逆转光线抑制下胚轴增长的现象。但GA的作用可被Ancymidol(GA生物合成的抑制剂)抵消；而Ancymidol对油菜素的作用却没有任何影响。 油菜素所引起的下胚轴的增长，可部分被TIBA或PCIB所抑制。因此，他们认为在这个体系中，油菜素与生长素(而不是GA)的作用有关。Mandava认为BRs与GAs的生理作用似乎是独立的和简单的加成作用。,脱落酸(ABA)：油菜素对菜豆幼苗第二节间的生长效应只是与GA的作用相类似，
26、而ABA则没有此种效应。Mandava认为BRs与ABA之间有强烈的拮抗作用。,乙烯：用油菜素处理绿豆芽，可强烈地抑制发根和上胚轴垂钩的张开。 Yopp等认为油菜素可能单独或与生长素联合诱导乙烯的生成。,拟南芥油菜素内酯突变体,wild,det2,dim,拟南芥油菜素内酯突变体,油菜素甾醇在农业上的应用 (The application of BR to agriculture),Mitchell等在早期使用天然油菜素粗 提物的试验中，便取得了使菜豆豆荚增产43.6%的良好效果，但因天然油菜素内酯的含量甚微，无法大量开展应用研究。由于人工合成油菜素内酯取得成功，并在一系列的应用试验中表现了良好
27、的苗头，为农业上的应用提供了可能性，展现了广阔的前景。,促进作物生长,增加营养体收获量,人工合成表油菜素内酯(epibrassinolide)的水溶液喷雾，取得了良好的增产效果。增产率为：莴苣30%，萝卜15%，马铃薯25%，菜豆与青椒67%，在温室试验中菜豆与青椒增产35%。,提高座果率，促进果实肥大,油菜素内酯处理西红柿，在自然座果良好期(510月，露地)增产20%，在自然座果不良期(113月，薄膜温室)增产156%。 葡萄进入开花盛期6天后，用油菜素内酯处理果穗，着果数增加156%，子房重增加140%，但全部有核。,提高结实率，增加粒重,小麦盆栽试验在开花、灌浆期处理，由于提高了弱势小花
28、的结实率和粒重而使产量增加10%。 人工合成的高油菜素内酯(homobrassinolide)于水稻开花、灌浆期处理，取得15%左右的增产效果。 玉米在抽丝初期 开始用油菜素内酯连续处理果穗3次，粒数和重量增加1020%。,提高作物的耐冷性,油菜素内酯处理水稻幼苗，在人工控制低温区(1518)生长一个月后，处理组较对照组叶长增加11%16%，茎叶干重增加15%；在高温区(7月，玻璃房中)，处理组茎叶和根干重均较对照组有所下降。 油菜素内酯处理水稻种子，在早春播种条件下，于室外生长两周后调查表明：处理组较对照组成苗率增加12.8%，苗高增加11.8%；整株干重增加13.6%。在夏播的条件下，成苗
29、率和苗高无明显差异，而处理组干重却较对照组下降14.3%。,低温处理试验中(10，人工气候箱内)，发现水稻幼苗电导率处理组要比对照组小51%30%。这说明油菜素内酯处理可降低在低温下细胞内离子的外渗，表明对生物膜具有一定的保护作用。 在低生长温度下用油菜素内酯处理过的西红柿、茄子、黄瓜等的幼果能正常地膨大。,减轻药害，提高耐病性,Simetryn是广泛使用的一种田间除草剂，但对作物易引起叶尖枯萎的药害，严重时植株会停止生长，整株死亡。用油菜素内酯浸根处理过的水稻幼苗，可消除或大大减轻Simetryn的药害。其原因是处理过的幼苗蒸腾量下降，稻株对Simetryn的吸收量减少，同时还可解除或部分解
30、除Simetryn对叶片光合作用的抑制。 日本全农称油菜素内酯能提高作物的耐病性，并将其作为植物耐病性增强剂申请了专利。 在水蜡树的发根试验中观察到，在高油菜素内酯处理区，试验材料无腐败枯死现象；而无处理区则有50%左右腐败枯死。 棉花种子低温发芽试验中，用BR浸种过的种子在发芽中无腐败死种现象。而对照区有1/3的种子腐败而死。,在组织培养中的应用,竹松等比较了高油菜素内酯和苄基腺嘌呤(BA)对40种植物愈伤组织的增殖和分化的影响。结果表明，在和2，4D并用的情况下，高油菜素内酯与BA相比，促进增殖的植物种类略多些，而抑制增殖的植物种类少得多，且受到抑制的程度更低。因此油菜素内酯有可能适用于迄
31、今在植物组织培养中有困难的某些植物。,从蜂蜡中提取出的油菜素甾醇类物质能明显促进水稻幼苗发根，提高根的鲜干重，使地上部伸长和增重。 BR能显著提高蚕豆幼苗株高、根长和干物质累积量。 用BR喷洒小麦叶面，使旗叶可溶性糖含量降低，加速糖的转化和运输，提高了旗叶叶绿素含量。增加穗粒数，提高千粒重。 用BR溶液拌培养料栽培平菇，促进平菇菌丝体生长和菌蕾形成，收菇时间提前，增加产量。,BR在农业上的应用研究进展很快，效果较明显，国内外已有许多关于BRs制剂的专利和注册出售，包括水稻、玉米、土豆、薯类、大豆、瓜类、山药、葡萄、柑桔、桃、苹果、柿子及花卉等专用制剂。 BRs在农业上的应用主要是促进作物生长、增加生物量和谷物产量，减少环境胁迫(温度、病害、农药等)的危害，插技生根和花卉保鲜等。,
