1、- 1 -影响 PCR 扩增因素的分析邱先伟(甘肃农业大学食品科学与工程学院 12 级生物工程，甘肃 兰州 730070)摘要: PCR 的发展可以说是从 DNA 合成酵素的发现缘起。DNA 合成酵素最早于 1955 年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的 Klenow fragment of E. Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素 , 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化，PCR 技术的广泛应用，研究 PCR 技术的影响因素闲的愈来愈重要。关键词: 多聚酶链式
2、反应 PCR 扩增技术 多重 PCR 前言:关于 1983 年 Mullis 等发明了种特异性 DNA 体外扩增技术聚合酶链式反应，PCR种体外模拟体内 DNA 复制核酸扩增技术少量 DNA 分子模板经过变性-退火-延伸多次循环已接近指数扩增形式产生大量目标 DNA 分子短短几十年该技术已经成常用、也重要分子生物学技术之其应用范围从基本基因扩增扩展基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等甚至扩展许多非生物领域该领域衍生出新方法更层出穷。1PCR 技术的原理PCR 技 术 的 基 本 原 理 类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 ， 其 特 异 性 依 赖 于 与 靶 序 列
3、两端 互 补 的 寡 核 苷 酸 引 物 。 PCR 由 变 性 -退 火 -延 伸 三 个 基 本 反 应 步 骤 构 成 ： 模 板DNA 的 变 性 ： 模 板 DNA 经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后 ， 使 模 板 DNA 双 链 或 经PCR 扩 增 形 成 的 双 链 DNA 解 离 ， 使 之 成 为 单 链 ， 以 便 它 与 引 物 结 合 ， 为 下 轮 反 应 作准 备 ； 模 板 DNA 与 引 物 的 退 火 （ 复 性 ） ： 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后 ， 温 度降 至 55 左 右 ， 引 物 与 模 板 DNA 单 链
4、 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA模 板 -引 物 结 合 物 在 TaqDNA 聚 合 酶 的 作 用 下 ， 以 dNTP 为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模板 ， 按 碱 基 互 补 配 对 与 半 保 留 复 制 原 理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保留 复 制 链 ， 重 复 循 环 变 性 -退 火 -延 伸 三 过 程 就 可 获 得 更 多 的 “半 保 留 复 制 链 ”， 而 且这 种 新 链 又 可 成 为 下 次 循 环 的 模 板 。 每 完 成 一 个 循 环 需 2 4 分 钟
5、， 2 3 小 时 就 能将 待 扩 目 的 基 因 扩 增 放 大 几 百 万 倍 1。- 2 -聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR) ，又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning Technique)，是一种根椐生物体内 DNA 复制的某些特点而设计的，在体外对特定 DNA 序列进行快速扩增的技术。2PCR 技术的发展2.1 常规 PCR 检测对细菌进行分类鉴定的常规 PCR 技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体 RNA(rDNA)、gyrB 基因、 toxR 基因等。自 6O 年代末，Woese 首次运用
6、rDNA 分析生物的系统发育以来，rDNA 数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的 16SrDNA 基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生 1的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌 16SrDNA 最直接的方式就是通过基因测序并与 Genbank、EMBL、DDB 等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA 基因也是非常保守的序列，由于它与 16SrDNA 基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA 基因间区序列来对细菌
7、进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16S rDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如 gyrB 基因(细菌中广泛存在的一种编码 DNA 的拓扑异构酶的 B亚基的单拷贝基因)、toxR 基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因 )等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。2.2 多重 PCR 技术多重 PCR 技术是在常规 PCR 基础上改进并发展起来的一种新型 PCR 扩增技术，其检测原理与传统 PCR 相同 .如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入 1 对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩
8、增出l 条以上的目的 DNA 片段。使用这一方法可以同时检测 1 个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。 ，可同时检测多种病原微生物。该技术自 1988 年 Chamberlain 首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。 23.影响 PCR 技术的因素研究进展3.1 PCR 扩增影响因素初探- 3 -多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA 片段的技术，此法操作简便,可在短时间内获得数百万个
9、特异性DNA序列的拷贝。影响PCR 反应结果的因素较多，其中如何获得高质量的基因组DNA 模板以及PCR 反应体系中各种成分因子的优化组合，是获得清晰可重复的扩增产物的前提，也是扩增反应能否成功的关键。 3为保证反应结果的稳定性和可靠性，同时降低反应成本， 必须系统地探讨基因组中DNA 的PCR反应体系中各种因素对扩增结果的影响，对PCR 进行优化，以期为目地基因PCR 反应成功提供稳定可靠的方法。通过对实验条件进行摸索，确定最佳的PCR 反应体系和反应条件，排除人为因素（如加样错误），据此反应体系和条件均能较好地扩增目标片段。实验结果发现PCR 反应混合物成分的比例和PCR 反应条件是PCR
10、 反应成功的关键，为了保证高质量的PCR 扩增产物应注意以下几点：DNA 模板的要求；引物与模板之间的比例，对PCR 的特异性也是非常重要的。dNTP 浓度过高可加快反应速度，但同时增加碱基的错误掺入率即错配率和实验成本, 而低浓度的dNTP 会降低反应速度以及产物量， 但可以提高实验的精确度。 PCR 反应的缓冲液。3.2 理化因素对人发DNA PCR扩增结果的影响受高温、酸、碱、日晒、雨淋等环境因素的作用, 致使其人发DNA发生质和量的变化, 影响DNA分析结果。用聚合酶链反应(PCR)可对人体的一些组织, 如血痕、毛发及牙齿等进行性别鉴定 4。实验研究了温度、湿度、pH 、福尔马林、乙醇
11、和土埋处理牙齿的PCR扩增, pH可影响DNA 的稳定性, 但pH在一定范围仍较稳定。pH 过高或过低均可引起DNA 双链间氢键的破坏而变性,甚至也可引起链内共价键的破坏而发生DNA 降解；福尔马林固定组织可以破坏DNA分子, 固定时间越长DNA 降解越多, 大部分DNA都降解成小片段,不适合RFLPs 分析。总之，实验最后证实温度、pH等均会影响PCR扩增。环境条件是复杂多样的, 对检材DNA的影响既可以是单因素作用, 也可能是多因素同时作用, 现仅报道部分理化单因素对人发DNA及其PCR性别鉴定结果的影响, 其他问题尚待进一步研究。3.3 影响多重PCR扩增效果的因素多重PCR要求不同引物
12、能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。实验进行不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比，结果表明，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR 的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩- 4 -增效果影响较小。在常规PCR 中，一个反应体系一般采用一个退火温度。有些研究小组的多重PCR 反应条件也采用一个退火温度，但也有一些研究小组在一个反应体系中采用多个退火温度。常规PCR 缓冲液使用标准缓冲液，由15mmol/LMg 2+，10mmol/LTrisHC1(PH8 3)50mmol/LK
13、C1 组成 10 。有文献报道TMAC、TritonX 100、明胶能增强PCR扩增的特异性 10 。因而，在多重PCR缓冲液中常加入1mmol/L TMAC01TritonX 1O0。经过多次对比实验，我们认为多重PCR理想的缓冲液为：15mmol/LMgC1 2，50mmol/L KC110mmol/L TrisHC1 pH一831mmol/LTMAC，01 TritonX 100，001 明胶。多重PCR(mutiplex PCR)技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，白1988年Chambercian等首次提出这一概念起 5、6 ，该技术已被广泛的应用于基因组结构
14、与功能基因及数量性状基因(quantitative traitlocus，QTL)的定位等研究 7-9。多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。此外，如须用激光诱导荧光电泳技术，如ABI373、ABI 377、ABI 3700、CEQ 2000等系列DNA序列分析仪分辨多重PCR的扩增产物，标记在引物5 端的荧光物质发生荧光衰变，影响多重PCR扩增产物的检测。本实验以328对5 端标有HEX或TET 或6一FAM 亚磷酸酰胺的引物及4O只cAU资源家系6F 。为材料，进行循环参数、PCR缓冲液
15、及反应体积的多重PCR优化反应体系对比实验。实验结果表明循环参数、PCR缓冲液成分等影响多重PCR 的扩增，而反应体积和循环次数对其扩增效果影响较小。 参考文献：1 张世秀，张新中，谢珍玉，周永灿。 PCR 技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用. 现代渔业信息, 2006 年 7 月 第 2l 卷 第 7 期 P11-132 张玉霞，黄鸣. 食品检验中多重 PCR 技术的应用. 中国卫生检验杂志 , 2008 年 5 月第 18 卷第 5期 P958-9603C.W.迪芬巴赫， G.S.德维克斯勒.PCR 技术实验指南M.北京：科学出版社，1998.4吴梅摘, 孙光云 .分析扩增D N A
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