1、化学小分子探针在药物发现中的应用仇文卫，汤杰华东师范大学化学系、药物化学研究所当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现以及靶点与活性化合物作用模式的确定，化学小分子探针在这两方面的特出优越性使其成为药物化学的研究热点。1、创新药物的发现、靶点与化学小分子探针药物可以挽救生命、治疗疾病、改善健康状况、 缓解痛苦和各种不适，因此，可以说药物改变着我们的生活，也影响着整个世界。然而，目前开发新药的费用平均每个高达数亿美元，尽管投入如此之高，从研发 到上市仍约需 10-12 年之久（图 1）。因此新药研发迫切需要新技术、新理 论，以提高效率、缩短周期。三三三三10,02,0 三三三 三三三三三三三三三
2、三三三三三三三三三三三三三 三三三三三三三三三三三2三3三 2三3三 2三3三3三4三三三三三10三12三三三三三3.5三.5三三三图 1. 新药研发过程现代药物的发现过程主要包括靶点(target) 的识别、先导物的发现、结构优化、临床前及临床试验等阶段，其中正确的靶点识别是影响整个过程的关键步骤之一。靶点也称为受体（receptor），是指与 药物分子在体内相互作用的功能性大分子，通常是某种蛋白质（绝大部分靶点是蛋白质）、核酸、离子通道或 DNA 等。药物分子在体内作用于靶点的特定部位，形成复合物，从而诱发生物化学及生理学上的变化， 产生药物效应，达到治疗疾病的目的。若能发现这些靶点，就可
3、以在此基础上建立相应的筛选模型， 对活性化合物进行高效率的活性评价。从而促进先导物发现和结构优化的进程。可见， 现今药物的发现 已越来越依赖于药物靶点的发现。那么如何解决药物靶点的发现问题呢？虽然，生命科学领域的研究近年来取得了巨大成就， 2001 年人类基因组工程的完成更是一个里程碑式的进步。然而，何种蛋白质是针对某种疾病的小分子药物的靶点，在目前基因水平上的生物技术仍然无法解决。随着后基因时代的到来，人 们逐 渐认识到蛋白质才是生理功能的执行者，也是生命现象的直接体现者。 这其中有可能蕴藏着开发疾病诊断方法和新药的“ 钥匙” ，在基因组学基础上开展蛋白质组学研究将有可能导致药物开发方面的实
4、质性突破。因此 针对药物发现的技术重心已经由基因组转向了蛋白质组。利用化学小分子的多 样性， 选择适当的活性小分子，设计合成能够高选择性地探测蛋白质的功能、结 构以及与活性小分子作用模式的探针化学小分子探针，可以为重大疾病的 诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构，从而为创新药 物的发现奠定基础。在药物发现过程中，化学小分子探针主要有以下几个方面的作用（图 2）：1. 针对靶点已知的有药理活性的化合物，可以进行以下三个方面的研究：(1)了解药物分子与靶点作用部位的结构信息，为进一步的结构改造提供帮助；(2)利用探针分子研究靶点蛋白在生理与病理状态下的分布情况，深入研究蛋白质的
5、功能；(3)利用探针分子进行细胞或体内的标记实验，可能会发现一些与活性化合物有交叉作用的靶点蛋白，从而为已知的小分子药物可能产生的毒副作用提供预测。2. 对于体内作用靶点未知，有药理活性的化合物，特 别是来自天然产物的活性化合物，可以将其设计成探针分子，通过对细胞或动物的标记实验来发现其体内的作用靶点，建立新靶点的筛选模型， 为先导物的结构优化服务。图 2. 化学小分子探针在药物靶点鉴别及靶点蛋白活性位点结构信息研究中的作用示意图2. 化学小分子探针的设计探针分子一般是以其母体化合物（最初的活性化合物）为基础，根据初步的构效关系设计合成的。设计 的探针分子应具有适当的活性，与靶点的作用机制应与
6、母体化合物保持一致，在不影响其活性的条件下，选择在活性分子的适宜位置引入各个功能部位。活性化合物与靶点的作用方式主要有两种：一是活性化合物中含有某些反应基团，可以与靶点蛋白的活性部位发生反应形成共价键，因此这种结合非常稳定，是不可逆的；另一种是活性化合物与靶点蛋白通过离子键、偶极-偶极相互作用、范德 华力、 氢键等分子间引力相互吸引，形成复合物，这种作用相对较弱、不稳定，是可逆的。2.1 ABPP 及 PAL-ABPP 化学小分子探针及其功能部位针对能与靶点蛋白形成共价作用的活性化合物设计的探针分子一般包括四个功能部位：结合基团(binding group, BG)，反应基团(reactive
7、 group, RG)、连接部位(linker unit)、报告基团(reporter group)通常也称标签 (tag)。由于此 类探针分子主要用于包括靶点发现在内的蛋白质功能的研究，是一种活性基于蛋白谱技术（activity-based protein profiling, ABPP）的探针分子，因此人们将这种探针分子称为 ABPP 探针 分子(图 3 A)。三三(in vitro)tag tagtag三三三三三 tag三三三三三三三三三三三三三三三三三三A:tag三三三三三三三三三三三ABP 三三三三PAL-BP三三三三三三三三/三三三三三三三三三三(in vitro)三三三三三三三三
8、三三三三三三三三三三三三三三三三B:三三三三三三三三图 3. ABPP 及 PAL-ABPP 探针分子标记靶点蛋白针对不能与靶点形成共价键，只能通过离子键、偶极-偶极相互作用、范德 华力、氢键 等分子间引力形成复合物，这种作用相对较 弱、不 稳定，是可逆的，因此就需要引入光亲和标记基团(photoaffinity labeling group, PAL)，其作用类似于反应基团。在探针分子与靶点蛋白形成复合物后经紫外光照射，光亲和标记基团分解产生很活泼的反应中间体卡宾，将探针分子标记(共价修饰)在靶点蛋白的活性部位，这 种探针分子可称为 PAL-ABPP 探针分子，也包括四个功能部位：结合基团、
9、光亲 和标记基团、链接部位、 报告基团(图 3 B)。2.2 结合基团结合基团(BG)是探针分子最重要的部分，理想情况下它必 须将探针分子特异性的导向处于功能状态下的靶点蛋白的活性位点，使探针分子与靶点作用，而不与环境中的其他生物分子作用。2.3 反应基团反应基团(RG)的作用是在探针分子进入靶点蛋白活性中心后，通 过反应将探针分子共价修饰在靶点蛋白的活性中心，使探针分子与蛋白质的牢固连接。2.4 光亲和标记基团光亲和标记基团可以在紫外光照射下将探针分子共价修饰在靶点蛋白上。通常被引入的光亲和基团包括苯基叠氮类(phenyl azides)、三氟甲基苯基双吖丙啶类(trifluoro meth
10、ylphenyl diazirine) 、二苯甲 酮类 (benzophenone)等(图 4)。N3 NRH HNRCF3N CF3 CF3HR三三三(365nm) .RHOPhPh hv350nmPhPhO.RCHPhPhOHR三三三(254 nm)三三三三 三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三三R=三三三三三三(三三三).图 4. 各种光亲和标记基团的标记反应三者之中，三氟甲基苯基双吖丙啶是最接近理想的光亲和基团。2.6 连接部位连接部位是连接结合基团、反应基团与报告基团的一段柔性的链状结构，它有以下两个方面的作用：在活性基团与报告基团间制造足够的空间，以避免探针分子立体结构的拥
11、挤而保持分子活性及提高标记的效率；链接基团可以是一段直链烷烃链或多聚乙二醇链，前者有利于提高探针分子的疏水性而有利于其透过细胞膜，后者对于疏水性的探 针分子来说可以增强其水溶性。2.7 报告基团报告基团(Tag)的作用是方便人 们简单快速的识别或纯化被标记的蛋白。最常用的报告基团有荧光基团(fluorescence group)及生物素(Biotin)等。荧光素如Rhodamine、FAM、FITC、BODIPY、Cy3、Cy5 等具有灵敏性高的特点，同时可以利用现代质谱技术定量检测标记蛋白。生物素(biotin) 由于其与 Avidin 蛋白有很强的特异性结合能力(10 15M-1)，因此可
12、以富集、纯化或识别被标记蛋白，Biotin与 Avidin 的复合物通常可使用盐酸胍溶液(guanidine-HCl)、SDS 溶液、Biotin 溶液等使其解析。 三三三三三 Biotin tagBiotin tag 三三三三 BiotinBiotinfish out三三三三三三三Avidn三三三三三三三三三fish outBiotin tag三三三三三三三三三三三三三三三三三三PAL-BP三三三三 Avidn三三三三 三三三三三三三三三三三三三三图 5. 生物素(biotin)富集、纯化、识别被标记的蛋白及肽片段3. “点击化学”（Click Chemistry ）在化学小分子探 针合成中
13、的应用Click chemistry(简称 CC)，又称点击化学，是最近几年发展起来的一种化学合成新技术，click 是点击鼠标的声音，意思是这个反应非常容易而且可靠，就像点击鼠标一样。2001 年，美国 Scripps 研究所诺贝尔奖获得者 Sharpless 等提出CC 这一概念，是指具有以下特征的化学反 应：反应 原料易得，反 应非常可靠，对氧气、水不敏感，产物立体选择性好、产率高，反应后处理及产物分离简单方便，一般不需要柱层析，反应副 产物对环境友好。其中最重要的“ click”反应是指炔基在 Cu(I)催化下与叠氮基形成稳定的 1, 2, 3-三氮唑化合物(也称 Huisgen 1,
14、 3-偶极环加成) 的反应 ，在 组合化学、靶点 导向的活性小分子合成及生物偶 联技术等方面有着较好的应用。CC 技 术的出现也极大地促进了化学小分子探针技术的发展。直到最近 ABPP 探针分子标记实验一直是在细胞或组织匀浆液中进行的(这些体外的蛋白组样品只能大致的反应蛋白质在活细胞或组织中的功能状态)，一个主要的原因是报告基团体积很大使得小分子探针的分子量通常在7001000Da ，限制了探针分子的吸收、分布，甚至可能改变探针分子的作用模式。美国 Scripps 研究所 Cravatt 等最早将 CC 与 ABPP 技术结合起来，发展了CC-ABPP 策略：靶点蛋白首先被探针分子标记 (PS
15、-N3)，然后在 Cu(I)催化下与标签分子发生环加成反应生成三氮唑分子将标签连接到探针分子上(图 6)，克服了 ABPP 探针 分子的上述缺点。CC-ABPP 探针分子设计包括结合基团、反应基团、连接部位、潜在的报告基团(一般为体积很小的叠氮基，在探针分子标记了靶标蛋白后，可与带有炔基的 报告基团发生“click ”反 应将报告基团引入探针分子；或也可为炔基，可与带有叠氮基的报告基团发生“click” 反应将报告基团引入探针分子) 。CC-ABPP 策略与 ABPP 策略的主要区别在于其报告基团是在探针分子标记了靶标蛋白后，通过“click ”反应引入的，这样就避免了 ABPP 实验中，报告
16、基团体积过大所造成的一些不足。同理对于与靶点蛋白非共价作用的活性化合物，Cravatt 等设计了 PAL-CC-ABPP 探针分子，其功能部位包括结合基团、光 亲和标记基团、 连接部位、潜在的报告基团。NuSOPh(CH2)6N3(P-N3) Nu(CH2)6N3 TagCu(I) Nu(CH2)6NTag三三图 6 CC-ABPP 策略PS-N3 是一个活性 导向的多靶点探 针分子，它可用于对谷胱甘肽硫转移酶(GSTO 1-1)、醛脱氢酶 (ALDH-1)、巴豆酸 酶(ECH-1)等的标记。 Cravatt 等运用CC-ABPP 策略，将 PS-N3 与 COS 细胞孵育， 细胞匀 浆后加入
17、炔基罗丹明（ ）在 Cu(I)催化下发 生“click” 反应，将 荧光素罗丹明引入到探针分子中方Rh便标记后的检测。结果显示 PS-N3 能够在原位(in situ)标记 GSTO 1-1。它们甚至将 PS-N3 注射到老鼠体内，处死老鼠后取其心脏组织匀浆后加入炔基罗丹明进行“click”反应，结果显示探针 分子能够在动物体内标记 ECH-1(图 7)。小分子探 针PS-N3 很容易被 细胞吸收，并在原位共价标记靶标蛋白，Cravatt 等将其与乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)孵育后细胞匀浆，加入炔基罗丹明进行“click” 反应。结果显示运用 CC-ABPP 策略针对 MDA-MB-2
18、31 标记到的一些靶点蛋白，是以前运用 ABPP 策略在体外 (in vitro)标记从来没有发现的，这些靶标蛋白可能成为治疗此类疾病的一些新靶点。图 7. 运用 CC-ABPP 探针分子在细胞内与动物体内标记靶点蛋白5. 回顾与展望化学小分子探针在蛋白质组学的研究中，特别是在功能蛋白质组学的研究中扮演着越来越重要的角色。运用化学小分子探针标记技术使得大量与疾病相关的靶点被发现，活性小分子与其靶标蛋白之间的作用模式被确定，为药物的发现与发展提供必需的重要信息，是药物发现与发展过程中强大的工具。然而 2003 年之前化学小分子探针标记实验大部分还在体外进行，很多情况下并不能准确反映蛋白质的相关信息，只能大致的揭示活细胞或动物体内组织中蛋白质的功能状态。美国 Scripps 研究所 Cravatt 等将“click”化学引入到小分子探针的设计中，在研究蛋白质组学的过程中能更真实的反映出活细胞或动物体内组织中蛋白质的功能状态，发现与疾病相关的靶点蛋白。化学小分子探针技术日趋成熟，在药物发现的重要环节如靶点发现及相关蛋白质功能的研究中起着越来越重要的作用。
