1、发酵工程 Fermentation engineering授课教师 张书祥2013.2.28,发酵工程概述 1、发酵工程的定义,发酵,发酵工程: 微生物（发酵） + 工程技术利用微生物的性状和机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品或为人类服务的过程。如抗生素、酒类、有机酸、基因工程药物等的生产。发酵过程是以微生物反应为核心的，因此，发酵工程又被称为微生物工程。,2、发酵工程与生物工程的关系 生物工程： 生命科学应用于产业方面，称为生物工程学。也就是利用生物体（生物作用剂：微生物、动物细胞、植物细胞等）的机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品的过程。生物工程包括：发酵工程、酶工程 、
2、基因工程 、细胞工程 。发酵工程是生物工程的重要组成部分，在生物工程中处于中心地位。无论是从微生物得到酶或用基因工程菌获得产品都必须依赖发酵工程技术。发酵工程的发展直接影响生物工程的进一步发展。,3、发酵工程与化学工程、生化工程的比较工业发酵的过程是依靠微生物细胞生命活动获得目的产物的过程，从根本上区别于化学合成工业和生化工业。在工业化学过程中没有生物活性物质参与催化。工业生化过程属于由酶催化的体外酶反应过程，酶具有生物活性。当酶失活、辅酶耗尽，过程就停止了。,4、发酵工程课程主要内容4.1 发酵工程的微生物学原理 第一章 绪论：发酵工程基本概念、发展史、应用、发展趋势等 。 第二章 工业微生
3、物（发酵的生物学基础）：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等的种类、来源，微生物选育、保藏、复壮。 第三章 微生物的发酵机理（发酵的生物化学基础）：糖代谢，脂肪代谢，蛋白质代谢、氨基酸代谢及其调控等。 4.2 发酵工程的工程学原理第四章 培养基及其设计、制备、优化、灭菌第五章 空气除菌的工艺及设备 第六章 生产菌种的扩大培养及保藏,第七章 发酵过程的工艺控制第八章 发酵参数的检测第九章 发酵动力学 第十章 发酵设备 第十一章 工业发酵的染菌及防治 第十二章 发酵产品的提取、精制工艺及设备第十三章 发酵工厂工艺设计 4.3 发酵工程产业实例第十四章 传统发酵第十五章 固定化细胞发酵第十六章 清洁生产技术
4、,上 游原料 原料处理 培养基的配制、设计与灭菌菌种的选育 保藏菌种 种子制备 发酵培养空气 空气除菌 无菌空气下 游发酵液 预处理 初步纯化 精制加工 成品工艺、设备、传统、现代,菌种筛选,摇瓶种子,种子罐种子,发酵罐生产,5、 发酵工程参考书,发酵工程 自编 2012.11 发酵工程 徐岩主编 高教出版社2011.6 发酵工程原理 肖冬光主编 中国轻工业出版社2004.7 发酵工程原理与技术 李艳主编 高教出版社2007.1 微生物工程 曹军卫主编 科学出版社 2002.8生物工艺学（俞俊棠 唐孝宣） 华东理工大学出版社 发酵工艺原理（熊宗贵）中国药科大学出版社 发酵工程与设备 轻工出版社
5、 生物工程设备（梁世中）轻工出版社 微生物工程（焦瑞身） 化学工业出版社 Principles of Fermentation Technology (Stephen J. Hall, Peter F. Stanbury &Allan Whitaker),6、课程网络教学登陆教务系统精品课程网络平台，可查阅教学PPT，教学大纲、复习题、课程简介等。7、及成绩评定办法平时成绩：占总成绩30%，包括：课堂的出勤率、平时学习态度及与老师的交流、讨论等。期末考试：占总成绩70%，笔试，根据学校统一安排进行。,第一讲（2013.2.28）第四章 培养基及其设计、制备、优化、灭菌 第一节 培养基的类型 第
6、二节 发酵培养基的成分及来源 第三节 发酵培养基的设计和优化 第四节 发酵培养基的灭菌及相关设备,发酵培养基：发酵培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖合成产物所需的一组营养基质。同时培养基也为微生物生长、代谢、产物积累提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,发酵生产培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。,第一节 培养基的类
7、型,培养基按其组成物质的成分、状态、用途可分为三大类型,1、按培养基成分,1.1合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律等,培养基营养单一，价格较高，重现性高。不适合用于大规模工业生产。,1.2天然培养基: 原料天然,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,1.3半合成培养基 : 既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基称之为半合成培养基 。 原料价格适中，适于工业化生产 。2、按状态,2.1固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。2.1
8、.1凝固培养基：1.5%2%琼脂或5%12%明胶。2.1.2非可逆性凝固培养基：血清凝固或无机硅配成的凝固培 养基2.1.3天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基。,固体培养基特点： 优点：体积小，废料少，可直接利用； 缺点：三传难，检测难。2.2半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% 。主要用于微生物的鉴定。 2.3液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，有利于氧和物质的传递，传热等。是发酵工业大规模使用的主要培养基类型。,3、按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基
9、三种 3.1 孢子培养基: 供菌种繁殖孢子用的一种常用的固体培养养基质。营养不要太丰富（特别是有机氮源）生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小麦培养基、大米培养基、玉米碎粒培养基及琼脂斜面培养基。,3.2 种子培养基: 供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体生长得粗壮，成为有活力的“种子”。一般指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。种子培养基的营养成分应比较丰富和完全，氮源和维生素的含量要高些，但固形物含量较低为好，这样可提高溶氧含量。应考虑微生物代谢过程中能维持稳定的pH。最后一级种子培养基的成分应接近发酵培养基，这样有利于种子的适应性。,3.3 发酵培养基：是供菌体生长、繁殖和合成
10、产物之用，发酵培养基的组成应完整，浓度适中。注意速效和迟效营养的搭配。注意合成产物所需的前体、和促进剂等，注意与种子培养基组分的关联。 3.4 补料培养基：发酵前期培养基稀薄一些，过一段时间， 开始间隙或连续补加各种必要的营养物质，如：碳源、氮源、前体等。补料培养基可单成分加入，也可制成复合培养基加入。,第二节 发酵培养基的成分及来源,1、碳源,1.1作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。,提供合成目的产物所必须的碳成分。,1.2来源,糖类、醇类、油脂、有机酸、正烷烃,1.3工业上常用的糖类,1.3.1葡萄糖,工业上常用淀粉水解制糖 淀粉水解糖的制备方法（1）酸解法
11、：用盐酸催化，在高温、高压条件下水解转化淀粉，盐酸的用量0.5%0.8%。优点：具有生产方便、设备要求简单、水解时间短，设备生产能力大 。缺点：设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压。所发生的化学变化是很复杂的，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低 。对淀粉原料要求较严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低，这些是酸解法存在的待解决的问题。,淀粉低聚糖（各种糊精）麦芽糖葡萄糖龙胆二糖5-羟甲基糠醛有色聚合物蚁酸和其他有机物,（2）酶解法：液化和糖化两步骤，双酶法， -淀粉酶液化，糖化酶糖。优点：
12、酶解反应条件较温和。因此，不需耐高温、高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易运作。微生物酶作用的专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率(出糖率)高。可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。用酶解法制得的糖液颜色浅，较纯净，无异味，质量高，有利于糖液的充分利用。 缺点：应时间较长，需要的设备较多，需要具有专门培养酶的条件，而且酶本身是蛋白质，易引起糖液过滤困难。随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶制剂的大量生产，酶法制糖逐渐取代酸法制糖已是淀粉水解制糖的一个发展趋势。,淀粉调浆糊化液化糖化 （3）酸酶结合法：先用酸水解淀粉成糊精或低聚糖，然后用糖化酶糖化（4）酶酸结合法：
13、先用-淀粉酶液化，再用酸水解成葡萄糖葡萄糖液的质量指标：用DE值衡量，DE=（还原糖/干物质溶液相对密度 ）100%还原糖测定：费林氏法或碘量法（100ml溶液中所含的还原糖克数 ）干物质：用阿贝折光仪 （100g溶液中所含有的干物质的克数 ）,1.3.2糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物质：胶体成分、钙盐生物素,预处理：活性碳或非离子树脂等方法脱除生物素
14、,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,1.3.3 淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶有直链淀粉和支链淀粉。,优点：来源广泛、价格低可以解除葡萄糖效应,2、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,2.1 无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO
15、3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,2.2有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机
16、氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例 玉米浆：玉米淀粉生产的副产品（1）可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸（2）较多的乳酸（3）硫、磷、微量元素等,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。,3、碳氮比（C/N) 碳元素总量与氮元素总量之比。C/N影响菌体的生长和产物的代谢，还能调节pH。所以碳源与氮源的应用应有一个合适的比例。不同菌种，不同时期（生长阶段），甚至不同培养方式，对C/N的要求不同。最适C/N还与最适pH有关。,4、无机盐和微量元素,微生物在生长繁殖和代谢中，都需
17、要无机盐，无机盐提供多种金属元素和非金属元素。 P, Mg, S, K, Na, Fe, Cl, Mn, Zn, Co等作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，但高浓度时常表现出明显的抑制作用。,4.1无机盐的作用：a构成细胞内一般成分（P、S、K 、Ca、Mg、Fe等 ）一般功能 b生理调节物质：渗透压的维持（Na+等）c酶的激活剂（Mg 2 +等）特殊功能 a化能自养菌的能源（S、Fe2 + 、NO2- 、NH4+ ）b无氧呼吸时的氢受体（ NO3 - 、 SO4 2-等）微量元素的功能 a酶的激活剂（ Cu 2 + 、 Mn 2 +
18、、 Zn 2 + ）b特殊分子结构成分（ Co 、Mn 等）天然培养基一般不另加微量元素。,4.2 无机盐的来源：C源、N源、以盐的形式补充。P是培养基中特别重要的元素，是构成核酸，磷脂的成分，并参与ATP,GTP的能量转移反应。 硫：含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸）等的组成部分，辅酶的活性基。一般添加Na2SO4, MgSO4,Ca2+ 对淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等多种酶活性起到十分重要的稳定和活化作用。 常用CaCO3, CaCl2提供钙，一般不与K2HPO4一起使用。 使用时， CaCO3是单独灭菌，在培养基调到中性后才加入，在酸性培养基中易被分解，失去其缓冲能力。,K, Na, C
19、a 虽不参与细胞的组成，却是培养基中的重要成分。 Na 与维持细胞的渗透压有关，促使某些酶的产量。 K 与渗透压有关，并且是许多酶的激活剂，还可促进糖代谢。Ca2+ 以离子状态控制细胞透性和调节酸度。,Mg 某些细胞的叶绿素成分，是许多重要酶的激活剂， 常用MgSO4，注意在碱性溶液中会生成沉淀。 Fe 细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化氢酶的成分，对代谢产物的合成有较大影响。,Cl氯离子不具营养作用，对一些含氯代谢物（如：金霉素和灰黄霉素等）的发酵，还需加入0.1%KCl补充。其他一些微量元素， Mn，Zn，Co等，一般不需再加入,4.3 无机盐的用量：根据具体的产品，以实验决定， 4.4 使
20、用注意点 a. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须进行表面处理b、使用时注意盐的形式（pH的变化）,5、生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,5.1生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,前体指某
21、些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。如：青霉素G生产添加苯乙酸，红霉素生产添加丙酸丙醇等，合成L-丝氨酸添加甘氨酸。,5.2前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组份,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题,实际使用时的转化率在46-90%之间,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前
22、提的转化率。,5.3产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物，有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,6、水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言
23、而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,第三节 发酵培养基的设计和优化,参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,1、培养基成分选择（设计）的原则1.1 根据微生物的营养需求配制培养基 1.2 注意培养基营养物质的浓度和配比 如蔗糖适当浓度是营养，高浓度则成为抑制因子。 注意培养基的C/N对发酵的影响。如谷氨酸的发酵， C/N为4：1时，菌体大量繁殖，酸积累少，当C/N为3：1时产生大量的谷氨酸。 1.3 调节适当的物理化学条件 1.3.1 pH：发酵过程的
24、酸碱度会发生变化，一般可考虑,加入缓冲剂，如：KH2PO4 K2HPO4 1.3.2 渗透压和水分活度（Aw）：等渗溶液适宜微生物的生长。Aw表示微生物在天然环境中可实际利用的自由水或游离水的含量。 Aw=P/P0，即某溶液的蒸汽压（P）与纯水的蒸汽压（P0）的比值。各种微生物的生长范围Aw：0.9980.6，设计培养基时应考虑到Aw, G-生长的最小水分活度一般比G+高，表明通常G+比G-有较高的内部渗透压，酵母与 G+类似，丝状真菌范围大。,1.3.3 氧化还原电势Eh：好氧微生物生长Eh为： +0.3 0.4V，兼性厌氧微生物为：0.1V，厌氧微生物为： 0.1V。 1.4 根据培养微生
25、物的目的配制：产物是菌体：N源含量比较高产物是某种代谢产物：考虑代谢产物的化学组成。,1.5 尽量使用廉价易得的原料（8个代替） 以粗代精，以“野”代“家”，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代粮，以氮代朊 ，以“国”代“进” 2、培养基的优化方法 2.1 生态模拟 2.2 查阅文献：直接、间接的信息。 2.3 借助优选法或正交试验法精心设计培养基的配方。,2.4 试验比较：实验规模一般由定性到定量，由小到大。摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器扩大培养进一步进行配方优化,第四节 发酵培养基的灭菌技术及相关设备灭菌技术(工业生产、实验室）灭菌是指用化学或物理的方法杀
26、灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。,工业上常用灭菌方法：干热灭菌法湿热灭菌法辐射（射线）灭菌法化学药品灭菌法过滤除菌法 1、干热灭菌法：是一种极端的手段，温度高、时间长。 原理：氧化作用是干热灭菌的主要根据。温度系数Q10，即温度升高10，灭菌速度常数增加的倍数。 嗜热脂肪芽孢杆菌：2.86 枯草杆菌黑色亚种：2.72,2、湿热灭菌2.1湿热灭菌的原理：是直接用饱和蒸汽进行灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，使微生物细胞中的蛋白质、酶、核酸极易发生不可逆的凝固变性，导致短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济快速等特点，因此发酵工业中处理大量培养基时广泛采用湿热灭菌。嗜热
27、脂肪芽孢杆菌Q10 ：2.86(干热) 14.28(湿热)枯草杆菌黑色亚种Q10 ：2.72 (干热) 3.71 (湿热),2.2 湿热灭菌理论灭菌时间的确定生产上要选择合适的时间和灭菌温度，既彻底灭菌又使培养基营养成分的破坏减至最底限度。杂菌在一定温度下，受热死亡遵循一级反应动力学的规律这就是对数残留定律。-dN/dt=kN N菌的残留数（个） t灭菌时间，dN/dt 菌的瞬时变化速率，个/s k菌死亡的反应速度常数，1/s,-dN/dt=kN 积分得： t=2.303/ k（lgN 0/Ns ）N 0灭菌初始时培养基菌数，个/mlNs灭菌一时间段后培养基菌数，一般取0.001个/mlk 表示微生物的耐热性。灭菌温度T与菌死亡反应速度常数K的关系：对 于一定的菌种，灭菌温度与k 的关系可用阿累尼 乌斯方程表示：,k=Ae-E/RT 取耐热性芽孢杆菌的A、E值进行计算，lgk=14847/T + 36.127式中 A阿累尼乌斯常数，1/SE杀死细菌孢子的活化能，4.187J/molT热力学温度，KR气体常数，1.9874.18J/(K.mol)e2.71,3、工业生产培养基的灭菌 3.1 分批灭菌（实罐灭菌） 3.1.1 典型发酵罐接管图典型发酵罐接管图,谢 谢！,
