1、简 答 ： 一 、 细 胞 培 养 目 的 与 用 途1. 药 物 研 究 与 开 发 (1) 新 药 筛 选 :如 化 学 合 成 药 物 药 效 研 究 ,中 药 有 效 成 分 筛 选 与 鉴 定 等 . (2) 疫 苗 研 究 与 开 发 :如 病 毒 性 疫 苗 的 研 究 与 开 发 (肝 炎 病 毒 疫 苗 ,艾 滋 病疫 苗 等 ),肿 瘤 疫 苗 (多 肽 疫 苗 )等 . (3) 基 因 工 程 药 物 研 究 与 开 发 :如 干 扰 素 研 究 与 开 发 ,细 胞 生 长 因 子 研 究与 开 发 等 . (4) 细 胞 工 程 药 物 研 究 与 开 发 :生 物
2、活 性 多 肽 研 究 与 开 发 ,人 参 皂 甙 ,紫 杉醇 等 生 物 活 性 成 分 研 究 与 开 发 . (5) 单 克 隆 抗 体 制 备 :包 括 诊 断 用 单 克 隆 抗 体 ,治 疗 用 单 克 隆 抗 体 . 基 础 研 究 (1) 药 物 作 用 机 理 (2) 基 因 功 能 (3) 疾 病 发 生 机 理 2, 生 物 制 药 (1) 疫 苗 生 产 :如 病 毒 性 疫 苗 (肝 炎 病 毒 疫 苗 ,艾 滋 病 疫 苗 等 ),肿 瘤 疫 苗(多 肽 疫 苗 )等 . (2) 基 因 工 程 药 物 生 产 :如 在 临 床 医 学 中 具 有 治 疗 价 值
3、 的 一 些 细 胞 生 长 因子 如 干 扰 素 ,粒 细 胞 生 长 因 子 ,胸 腺 肽 等 (3) 诊 断 用 和 药 用 单 克 隆 抗 体 生 产 (4) 细 胞 工 程 药 物 生 产 :生 物 细 胞 内 的 一 些 生 物 活 性 多 肽 ,生 物 活 性 物 质等二 、 细 胞 培 养 基 本 条 件1,合 适 的 细 胞 培 养 基 合 适 的 细 胞 培 养 基 是 体 外 细 胞 生 长 增 殖 的 最 重 要 的 条 件 之 一 ,培 养 基 不仅 提 供 细 胞 营 养 和 促 使 细 胞 生 长 增 殖 的 基 础 物 质 ,而 且 还 提 供 培 养 细 胞
4、生 长和 繁 殖 的 生 存 环 境 . 2,优 质 血 清 目 前 ,大 多 数 合 成 培 养 基 都 需 要 添 加 血 清 .血 清 是 细 胞 培 养 液 中 最 重 要 的成 分 之 一 ,含 有 细 胞 生 长 所 需 的 多 种 生 长 因 子 及 其 它 营 养 成 分 . 3,无 菌 无 毒 细 胞 培 养 环 境 无 菌 无 毒 的 操 作 环 境 和 培 养 环 境 是 保 证 细 胞 在 体 外 培 养 成 功 的 首 要 条 件 .在 体 外 培 养 的 细 胞 由 于 缺 乏 对 微 生 物 和 有 毒 物 的 防 御 能 力 ,一 旦 被 微 生 物 或有 毒
5、物 质 污 染 ,或 者 自 身 代 谢 物 质 积 累 ,可 导 致 细 胞 中 毒 死 亡 .因 此 ,在 体 外 培养 细 胞 时 ,必 须 保 持 细 胞 生 存 环 境 无 菌 无 毒 ,及 时 清 除 细 胞 代 谢 产 物 . 4,恒 定 的 细 胞 生 长 温 度 维 持 培 养 细 胞 旺 盛 生 长 ,必 须 有 恒 定 适 宜 的 温 度 . 5,合 适 的 气 体 环 境 气 体 是 哺 乳 动 物 细 胞 培 养 生 存 必 需 条 件 之 一 ,所 需 气 体 主 要 有 氧 气 和 二氧 化 碳 . 细 胞 培 养 基 种 类 与 基 本 成 分 细 胞 培 养
6、基 的 种 类 很 多 ,按 其 来 源 分 为合 成 培 养 基 和 天 然 培 养 基 (目 前 使 用 的 培 养 基 绝 大 部 分 是 合 成 培 养 基 ),按 其物 质 状 态 分 为 干 粉 培 养 基 和 液 体 培 养 基 两 类 .干 粉 培 养 基 需 由 实 验 者 自 己 配制 并 灭 菌 ,液 体 培 养 基 由 专 业 商 家 提 供 ,用 户 可 直 接 使 用 ,非 常 方 便 .每 种 细 胞都 有 其 合 适 的 培 养 基 ,三 、 细 胞 冻 存 与 复 苏 要 点 与 注 意 事 项1、 细 胞 冻 存 要 点(1)冷 冻 过 程 要 缓 慢 .需
7、 要 冷 冻 保 存 的 细 胞 先 在 4 冰 箱 中 放 置 30-60 分钟 ;然 后 转 入 -20 ,放 置 30 分 钟 ;然 后 再 转 入 -80 放 置 16-18 小 时 (或 过 夜 );最后 放 入 液 氮 中 长 期 保 存 .有 条 件 的 地 方 ,可 用 程 控 降 温 仪 ,按 每 分 钟 -1 到 -3 速 度 降 温 ,一 直 到 -80 以 下 ,然 后 直 接 放 入 液 氮 中 长 期 保 存 . (2)冻 存 细 胞 必 须 处 在 对 数 生 长 期 ,活 力 大 于 90%,无 微 生 物 污 染 . (3)细 胞 浓 度 控 制 在 :110
8、7-5107/ml. (4)使 用 高 浓 度 血 清 或 蛋 白 保 护 剂 .一 般 情 况 下 ,用 于 冷 冻 保 存 完 全 细 胞生 长 培 养 液 中 血 清 浓 度 大 于 20%. (5)使 用 合 适 的 细 胞 冷 冻 保 护 剂 ,以 保 护 细 胞 在 冷 冻 过 程 中 免 受 冰 晶 破 坏 .目前 ,最 常 用 的 冷 冻 保 护 剂 是 DMSO(二 甲 基 亚 砜 ),使 用 终 浓 度 为 5-10%.但 是 ,有 些 细 胞 系 不 能 用 DMSO 作 为 冷 冻 保 护 剂 ,如 人 白 血 病 细 胞 系 HL-60.因 为 ,DMSO 能 诱 导
9、 HL-60 细 胞 分 化 .在 这 种 情 况 下 ,可 选 用 其 它 冷 冻 保 护 剂 ,如 甘 油(glycele),羟 乙 基 淀 粉 等 . 特 别 注 意 : (1)细 胞 在 冷 冻 过 程 中 在 -20 冰 箱 内 放 置 时 间 不 可 超 过 1 小 时 ,以 防 止冰 晶 过 大 而 破 坏 细 胞 .也 可 跳 过 -20 这 一 步 骤 直 接 放 入 -80 冰 箱 中 ,但 这 样做 细 胞 存 活 率 要 低 一 些 . (2)DMSO 稀 释 时 会 释 放 大 量 热 量 .因 此 ,DMSO 不 能 直 接 加 到 细 胞 液 中 ,必须 事 先
10、配 制 . (3)DMSO 必 须 是 细 胞 培 养 级 别 的 .新 买 的 DMSO 本 身 处 于 无 菌 状 态 ,第 一次 开 瓶 后 应 立 即 少 量 分 装 于 无 菌 试 管 或 瓶 中 ,4 保 存 .避 免 反 复 冻 融 造 成DMSO 裂 解 产 生 有 害 物 质 .并 可 减 少 污 染 机 会 .如 要 过 滤 DMSO,必 须 选 用 耐DMSO 的 尼 龙 滤 膜 . 细 胞 冷 冻 保 存 液 主 要 成 分 :冷 冻 保 护 剂 ,基 础 培 养 液 ,血 清或 蛋 白 . 常 用 细 胞 冷 冻 保 存 液 : (1)10%DMSO + 完 全 细
11、胞 生 长 培 养 液 (20%血 清 +基 础 培 养 液 ) (2)10%甘 油 + 完 全 细 胞 生 长 培 养 液 (20%血 清 +基 础 培 养 液 ) 悬 浮 细 胞 冷 冻 保 存 操 作 程 序 (液 氮 保 存 法 ): (1)取 对 数 生 长 期 细 胞 培 养 物 ,离 心 200-400g 5 分 钟 .用 粘 附 (贴 壁 )细胞 冷 冻 保 存 操 作 程 序 (液 氮 保 存 法 ): 2、冷冻保存细胞的解冻与复苏要点: (1)快 速 解 冻 .冻 存 细 胞 从 液 氮 中 取 出 后 ,应 立 即 放 入 37 水 浴 中 ,轻 轻摇 动 冷 冻 管 ,
12、使 其 在 1 分 钟 内 全 部 融 化 (不 要 超 过 3 分 钟 ). (2)解 冻 操 作 过 程 动 作 要 轻 .由 于 冷 冻 保 存 过 的 细 胞 变 得 非 常 脆 弱 ,不 仅解 冻 速 度 要 快 ,而 且 动 作 要 轻 .一 般 情 况 下 ,解 冻 后 的 细 胞 可 直 接 接 种 到 含 完全 生 长 培 养 液 的 细 胞 培 养 瓶 中 直 接 进 行 培 养 (1ml 冻 存 细 胞 液 加 入 到 25-30ml 新 鲜 完 全 培 养 液 中 ),24 小 时 后 再 用 新 鲜 完 全 培 养 替 换 旧 培 养 液 ,以 去 除DMSO.如 果
13、 ,细 胞 对 冷 冻 保 护 剂 特 别 敏 感 ,那 么 ,解 冻 后 的 细 胞 应 先 通 过 离 心 去除 冷 冻 保 护 剂 ,然 后 再 接 种 到 含 完 全 生 长 培 养 液 的 培 养 瓶 中 . 特 别 注 意 : (1)解 冻 时 务 必 注 意 安 全 ,预 防 冷 冻 管 爆 裂 .,要 带 手 套 ,用 镊 子 将 细 胞 冷冻 管 从 液 氮 中 取 出 ,放 入 37 水 浴 中 .切 不 可 直 接 用 手 ,以 免 冻 伤 . (2)冷 冻 管 在 水 浴 中 解 冻 时 ,液 面 不 可 超 过 冻 存 管 盖 面 ,否 则 ,易 发 生 污 染 .
14、解 冻 冷 冻 保 存 细 胞 的 离 心 方 法 : (1)从 液 氮 中 取 出 冻 存 的 细 胞 ,立 即 放 入 37 水 浴 中 快 速 解 冻 . (2)将 1-2ml 冻 存 细 胞 液 加 入 到 25ml 新 鲜 完 全 细 胞 生 长 培 养 液 中 ,轻 轻混 匀 . (3)用 80g 离 心 2-3 分 钟 ,弃 上 清 液 . (4)用 完 全 生 长 培 养 液 轻 轻 悬 浮 细 胞 团 ,并 计 数 细 胞 . (5)接 种 细 胞 到 培 养 瓶 中 ,起 始 密 度 为 3105/ml.四 、 细 胞 传 代 要 点 与 注 意 事 项1 细 胞 传 代
15、方 法贴壁细胞（1）洗掉旧培养液；（2） 、用无钙镁 PBS 洗涤细胞一至二次；（3） 、加入适量 Trypsin-EDTA 溶液方法一：37或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。方法二：37或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止 trypsin 作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。悬浮型细胞（1） 、吸去
16、细胞培养液，放入离心管中，离心 1000rpm、5min（2） 、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养。2 细 胞 传 代 时 注 意 事 项（1） 、紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半个小时后再进入。（2） 、所有的实验器材都要经过消毒处理，所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。（3） 、细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境，补加生长液后要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。（4） 、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只能进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。PBS，培养液和消化液应严格分开。（5） 、每天观察细胞状态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长至致密单层后即可传代。
