1、华南理工大学硕士学位论文鸡源益生菌的分离、筛选、鉴定与特性研究姓名:陈琼申请学位级别:硕士专业:生物化工指导教师:杨汝德20040501摘要摘 要本研究课题来源于广东省农业攻关项目“安全高效无残留的新型畜禽用微生态制剂的研制与应用”,文件编号为粤科技字2002141号。本实验内容是该项目的一部分,主要研究了从鸡的肠道中分离筛选出五种肠道菌,初步鉴定为肠道益生菌,在此基础上对各菌株的发酵特性进行探讨,并对各菌株拮抗致病菌和抗生素进行了探讨。同时也探讨了筛选出的菌株间的拮抗性及相容性。选用Bs培养基,从15天龄小鸡的盲肠中分离筛选出双歧杆菌。选用sL培养基,从lO天龄小鸡的小肠中分离筛选出乳酸杆菌
2、。选用Ec培养基,从30天龄小鸡的盲肠中分离筛选出屎肠球菌。选用BLI培养基,从30天龄小鸡的盲肠中分离筛选出地衣芽孢杆菌。选用麦芽汁培养基,从成年鸡的盲肠中分离筛选出酵母菌。对分离筛选获得的五种菌株进行初步鉴定:菌株B17l是双歧杆菌,菌株M16是嗜酸乳杆菌,菌株w019是屎肠球菌,菌株YB02是地衣芽孢杆菌,菌株B12l是酵母菌。双歧杆菌B L71为革兰氏阳性严格厌氧菌,最佳培养条件是初始pH值70,最适培养温度为40。采用正交实验方法,确定最佳培养基配方为酵母膏09胰蛋白胨06,大豆蛋白胨06,葡萄糖25,双歧因子02,生氏因子lO。发酵培养时间18h。在最佳培养条件下,B171的增殖菌
3、数可达62108个mL。嗜酸乳杆菌M16为革兰氏阳性兼性厌氧菌,发酵培养时间16h,增殖菌数可达7。l108个mL。屎肠球菌wOl9为革兰氏阳性兼性厌氧菌,发酵培养时间16h,增殖菌数可达8310sml。地衣芽孢杆菌YB02为革兰氏阳性好氧菌,其最佳培养条件为初始pH值65,最适培养温度3032。采用正交实验方法,确定最优培养基为酵母膏15,玉米淀粉20,Nail2P04+Na2HPO 402+O2,玉米浆20。发酵培养时间1820h,此时增殖菌数可达35109个mL。酵母菌B12l的发酵培养时间为1820h,此时增殖菌数可达124108个mL。拮抗病原菌实验表明,嗜酸乳杆菌M16的代谢产物在
4、体外具有抑制杀灭鸡大肠埃希氏菌O一78,鸡白痢沙门氏菌O一79,金黄色葡萄球菌C58000的作用。双歧杆菌B171和屎肠球菌W019对三种致病菌均有明显的抑制作用。地衣芽孢杆菌YB02对鸡大肠埃希氏菌O一78有抑制作用,对鸡白痢沙门氏菌079,金黄色葡萄球菌C58000有拮抗作用。酵母菌B12l对三种致病菌有拮抗作用。拮抗抗生素实验表明,双歧杆菌B17l对丁胺卡那霉素、新霉素、巴龙霉素有华南理工大学硕士学位论文耐药性,对青霉素、万古霉素、林可霉素和杆菌肽敏感。乳酸杆菌M16对丁胺卡那霉素、新霉素、坏丙沙星有耐药性,对林可霉素、庆大霉素敏感。屎肠球菌wol9对林可霉素、丁胺卡那霉素有耐药性对庆大
5、霉素、万古霉素、氨卞青霉素敏感。地衣芽孢杆菌YB02对林可霉素、磺胺嘧啶有耐药性,对庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氨卞青霉素、新霉素敏感。酵母菌B12l对环丙沙星、林可霉素、新霉素、杆菌肽有耐药性。双歧杆菌B171、嗜酸乳杆菌M16、屎肠球菌w019、地衣芽孢杆菌YB02、酵母菌B12l之间相互没有拮抗作用。关键词 益生菌;小鸡:分离筛选:动物微生态制剂一 垒呈!垦垒!AB STRACTThis study came from the key project of agriculture,Guangdong ProvinceTheproject,numbered yuekeji200214
6、1,wore“the development and application ofmicroecoIogics for animals which safe,effective and nonremained”This study was one part of this projectThe major research were follows:Fivekinds of strains which identified the probiotics were isolated and screened from theintestinal tract of healthy chickent
7、he functional properties of the five strains werestudied,the effect of inhibition and disinfection of Enteropathogen,drugresistance ofthese strains was also studied,and the antagonism among these five strains wasobservedUsing BS medium,the Bifidobacterium pullorum was isolated from the appendixof fi
8、fteendayold chickenUsing SL medium,the Lactobacillus was isolated from thesmall intestine of tendayold chickenUsing EC medium,the Enterococci faelis wasisolated from the appendix of thirtydayold chickenUsing BLI medium,the Bacitluslicheniformis was isolated from the appendix of thirty-dayold chicken
9、Using wortmedium,the Yeast was isolated from the appendix of thirtydayold chickenThe identification suggested that strain B 171 was Bifidobacterium pullorum,strain M 16 was Lactobacillus acidophilus,strain W019 was Enteroeocci faelis,strainYB02 was Bacillus licheniformisstrain B12 1 was YeastB 17 1
10、was anaerobicGrampositive bacteriaThe optimized fermentationconditions were:pH value of media 70,temperature 40。CUsing orthogonality test,the optimal prescription for fermentation were composed of 09yeast extract06tryptone,O6soya peptone,2,5glucose,02bifidus,t0growth factorTheterminal time was at i
11、8 hoursThe highest biomass concentration obtainedexperiments was 62x t08mLM16 was anaerobicGrampositive bacteriaThe terminal time was at 16 hoursThe highest biomass concentration obtained experiments was 71 x 108mLW0 19 was anaerobic,Grampositive bacteriaThe terminal time was at 16 hoursThe highest
12、biomass concentration obtained experiments was 83x 105mLYB02 was aerobic,Grampositive bacteriaThe optimized fermentationconditions were:pH value of media was 65temperature was 3032Usingorthogonality testthe optimal prescription for fermentation were composed of 15yeast extract,20corn starch,02+O2NaH
13、2P04+Na2HP04,20growth factorThe terminal time was at 1820 hoursThe highest biomass concentration obtainedIIlf#南理r大学硕士学位论文experiments was 35x 109mLAccording tO the growth curve of B2l,the terminal time was at 1820 hoursThe highest biomass concentration obtained experiments was 124x 108mLThe results o
14、f inhibition and disinfection test showed that the merabolite of M L6could destroy the pathogenic Ecoli 0-78,Salmonella pullorum O79 and SaureusC58000 in vitroThe growth of Entropathogen had been inhibited by B17l and W019obviouslyThe growth of 0-78 had been inhibited by YB02YB02 had antagonisticact
15、ivity on the O79 and C58000And B12 l had antagonistic activity on 0-78,O一79and C58000According to the results of drugresistance testB 17 l had drugresistance tOamikacin,neomycin,paromomycin,and was sensitive tO penicillin,vancomycin,lincomycin and bacitracinM 16 had drugresistance tO amikacinneomyci
16、n,ciprofloxacin,and was sensitive to lincomycin and gentamicinW019 haddrugresistance tO lincomycin and amikacin,was sensitive tO gentamicin,vancomycinand ampocillinYB02 had drugresistance to lincomycin and sulfadiazine,and wassensitive tO gentamicin,amikacin,ciprofloxacin,sulfadiazine,neomycinB12 l
17、haddrugresistance tO ciprofloxacin,lincomycin,neomycin and bacitracinThere has no antagonism among B17l,M16,W019,YB02 and B12IKey words:Probiotics;chicken;isolation and screening;microecoIogics for animals华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果
18、作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名: 健菇、 日期:孵年g月,名日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口,在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密叼。(请在以上相应方框内打“4”)作者签名:豫话、导师签名:物泓缇、 1 U r、 。日期:训年占月嵋
19、日日期:弦矿降矿月9日第一章绪论第一章绪论11概述111动物微生态与动物微生态学1111动物微生态在动物胃肠道的微生态系统中,微生物之间及微生物和宿主之间存在着错综复杂而又相对稳定的关系,动物胃肠道内的微生物群落的组成取决于微生物与宿主动物之间的交互作用,宿主为微生物提供栖息的环境,而微生物又提高了对有害细菌感染(尤其是胃肠道的感染)的抵抗能力m。随着对动物胃肠道微生物群落研究的进一步深入,人们对胃肠道微生物的种类也有了较多的了解。胃肠道微生物按其在肠道内生存并定居的时间长短可以分为固定群落(autochthonouS或indigenous)和过路群落(al lochthonous或trans
20、ient),前者是指在胃肠道占有特定区域的微生物,后者则指那些不能在健康动物胃肠道内长时间滋生的微生物。也可将胃肠道内的微生物群落分成共生性细菌、机会性细菌和致病性细菌。共生性细菌是动物肠道的主要菌群(90),包括球菌、丙酸菌、乳酸菌及双歧杆菌等。这类细菌有利于宿主,细菌将负责的碳水化合物(纤维素或非淀粉多糖)发酵成为乳酸或挥发性脂肪酸(如丙酸),乳酸在肠道形成酸性环境对其他致病菌可产生“竞争排除作用”,但乳酸堆积过多也会刺激肠道蠕动,使肠道内容物排空加快。机会性细菌约占lO,包括无病原性的大肠杆菌、链球菌及肠球菌等。这类细菌视肠道环境丽改变停留在肠道的数量及时间。致病性细菌的含量极少(001
21、),包括梭菌、葡萄球菌、伪单胞菌、病原性大肠杆菌、曲型菌及部分真菌。这类菌群不仅具有致病性,同时会消耗宿主的能量,而其发酵产物(如NH。、H:S等)也可能对宿主有害。亦可以将肠道微生物分为需氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物三大类w。在动物正常肠道微生态系统中优势菌群为厌氧菌,占99以上,兼性厌氧菌和好氧菌不到的121。应该说对动物胃肠道内微生物的研究重点最初是在粪便中的微生物,但是现在则侧重于研究那些进入胃肠道内容物和肠道不同区段与上皮粘膜相关联的微生物。研究3种成年动物粪便中微生物区系的组成(见表i1),发现肠道内相对稳定的微生物群落的形成有助于动物提高抵抗力,免受外来有害细菌的感染,特
22、别是对正常健康动物的胃肠道的感染,无菌动物比具有完整胃肠道微生物群落的动物更易感染疾病-。正因为动物胃肠道内微生物群落在增强动物机体抵抗力、调节胃肠道生态环境以及有利于动物对营养物质的消化与吸收等方面的特殊功效,围绕这些功效开展深入研究后,由Dubos于1965年首先提出了动物胃肠道微生态学的概念,随后Sazage对于Dubos提出的概念进行了修改。国内康白于1988年正式提出了微 华南理工人学硕士学位论文生态学的概念与理论t。I。表tl 3种不同成年动物粪便微生物区系组成(Log CFUg-L)Tabt e卜llicrobiat community in faces of chicken,P
23、ig and dog(Log CFU91)微生物类别 鸡 猪 狗11 1 2鸡肠道菌群的特点从雌鸡出壳至成年鸡,肠道菌群变化呈现一定的规律性。出壳后不久,肠道内即可检出链球菌和肠球菌。采食后第三天乳杆菌在十二指肠内迅速增殖,到7同龄时小肠菌群已基本形成。13日龄时盲肠开始出现双歧杆菌、拟杆菌、真细菌和消化球菌,到25目龄时盲肠菌群也基本建立。成年鸡的嗉囊中以乳杆菌为最优势菌群,链球菌和肠杆菌也不少。小肠菌群的构成与嗦囊相似,也以乳杆菌占绝对优势。盲肠中主要菌群为专性厌氧菌:双歧杆菌、拟杆菌、真细菌、消化球菌和梭菌,其次为链球菌、乳杆菌和肠杆菌。鸡的大肠很短,肠道菌群主要在盲肠内”ql。11 1
24、3动物微生态学及其四个主要理论动物微生态学定义为研究动物体内微观环境中的正常微生物及其与宿主相互2第一章绪论关系的微生态学分支。动物微生态学理论主要包括动物胃肠道内的微生态平衡理论、微生态失调理沦、微生态营养理论和微生态防治理论1l。微生态平衡理论是指动物胃肠道内正常微生物群落与动物机体本身之间以及微生物群落之间,在长期的进化与演变过程中形成的相互依赖、相互制约的一种生理性微生态平衡状态。这些微生物群落能在动物胃肠道内生存并生长,能耐受种种不良环境及抗菌物质,并且能避免在动物肠道蠕动时被排出体外,可见在动物胃肠道内的正常微生物群落具有很强的自我调控与竞争性排异能力w。相对而言,动物微生态失调理
25、论则指正常的动物微生态平衡在外界环境的影响下,由生理性微生态平衡状态转变为病理性微生态失调状态,这些外界环境因素主要指抗生素、激素、药物和同位素的使用以及疾病感染等w。何明清研究发现,正常仔猪的小肠内需氧菌与厌氧菌之比为l:100,而腹泻下痢时需氧菌与厌氧菌之比为l:l,即仔猪下痢时大肠杆菌等需氧菌的数量显著上升,乳杆菌等厌氧菌的数量却明显下降,也就是由于肠道微生物群落的微生态平衡被打破,致使仔猪发生了病理学下痢91。动物微生态营养理论则是指动物机体内正常微生物群落对其宿主的营养作用,即这些微生物既可直接参与物质代谢,为动物机体提供营养物质和生长刺激因子,又可提高动物机体的抵抗力,促进动物机体
26、对营养物质的消化与吸收|。Torrallardona:o等发现,猪肠道微生物可以合成氨基酸并被动物吸收利用”I。动物微生态防治理论即指依据动物胃肠道微生态系统的客观规律,因势利导,改善胃肠道微生态环境,建立生物量更高的微生态平衡,起到防治疾病和促进动物生长之功效|。112饲用抗生素局限性和负面效应动物微生态制剂的起源,可以说起因于抗生素的广泛使用。近10年来,由于科学水平的提高,对抗生素应用的副作用有了深刻的认识。近年来,国内外不断出现的人畜共患病(禽流感、SARS等)和禽畜产品安全性问题,引起了人们的高度关注甚至恐慌。因此,许多国家的政府管理部门加大了对有害饲料添加剂和药物使用的监控力度,严
27、格限制和禁止使用抗生素等作饲料添加剂。使用饲用抗生素主要有以下几个方面的局限性u”:抗生素的滥用引起动物内源性感染或二重感染。抗生素的使用在抑制致病微生物的同时,也抑杀了动物内源性微生物,扰乱了微生物系统中种群或群落间相互制约的格局,破坏了微生态平衡,造成原籍菌或过路菌(主要指条件致病菌)过度繁殖而出现定位转移,从而引起二重感染或内源性感染。抗生素的使用引起耐药菌的产生,因而抗生素治疗疾病越来越不理想。而微3华南理工大学硕士学位论文生态制剂则从调整生态失调、恢复生态平衡入手,不存在抗药性这一弊端。长期使用抗生素可使畜禽细胞免疫、体液免疫功能下降,甚至导致动物发病或死亡。抗生素在畜产品中残留,对
28、公共卫生产生不良影响,直接威胁着人类身体健康与安全。基于使用抗生素的弊端日益凸现,与抗生素和特异性预防制剂(如疫苗)等明显不同的,具有广谱的、非特异性抗菌、抑菌和杀菌作用的动物微生态制剂便应运而生。12动物微生态制剂概述121动物微生态制剂的定义动物微生态制剂是指在动物微生态学理论的指导下,调整微生态失调、保持微生态平衡、提高宿主健康水平或增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质制成的制剂(如寡糖类制剂),它包括益生素(ProbiotiCS)、益生元(PrebiotiCS)和合生元(SynbiOtiCS)等。因此说动物微生态制剂也是兽医生物制品的一种。122动物微生态制剂所用菌株1989
29、年美国食品与药物管理局(FDA)与饲料协会(AAFCO)发布了可以直接饲喂动物的安全菌株43种,其中乳酸菌类17株,双歧杆菌类6株,芽孢杆菌类5株,拟杆菌类4株,霉菌类2株(黑曲霉、米曲霉),酵母菌类2株,球菌和丙酸菌类7株。通常认为安全的直接饲用微生物种类见表12。我国农业部1999年公布了12种可以直接饲喂动物的饲料级微生物菌种,包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌m,。目前养殖生产中应用的动物微生态制剂多数是由以上单一或多种菌株加工而成的。1221乳酸菌乳酸菌是动物微生态制剂中研究报道得
30、最多的一类,是一种可以分解糖类产生乳酸的革兰氏阳性菌,厌氧或兼性厌氧生长。乳酸菌在pH值3045时仍可生长,对胃中的酸性环境有一定的耐受性。在动物体内通过生物拮抗降低pH值,阻止和抑制致病菌的侵入和定植胃肠,特别是抑制大肠埃希氏菌、白痢沙门氏菌等病原菌的生长。同时通过竞争结合位点,抑制病原菌的生长m。乳酸菌亦可通过调节肠道pH值,以激活胃蛋白酶促进胃肠蠕动,帮助食物的消化吸收减轻涨气和促进肝脏功能。乳酸菌还能降解亚硝胺、氨、吲哚、粪臭素等有害物质,4第一章绪论维持肠道中正常的生态平衡,活菌体和其代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶(SOD),能消除氧自由基的不利作用,增强体液免疫和细胞免疫Il
31、61。乳酸菌可用于哺乳期和断乳期动物的饲料中。此外,乳酸菌能够通过增加小肠表面积来提高其消化功能,l。乳酸菌的特点:是多种动物消化道主要的共生菌,能形成正常菌群:在微需氧或厌氧条件下产生乳酸:有较强耐酸性;产生一种细菌素(Bacteriocin),能有效抑制枯草杆菌、葡萄球菌的生长【16l。乳酸菌的缺点是耐热性差,6575条件一F死亡饲料颗粒化过程中瞬间高温即可将其杀死。目前主要应用的有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌。表t-2可以直接用于生产微生态制剂的益生菌Table 1-2 Microbial species directly used to produce microorganism ad
32、ditives中英文名称黑曲霉Aspergillus niger凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans地衣芽孢杆菌BacilluS licheniformis枯草杆菌Bacillus subtilis多毛拟杆菌Bacteroides capillosus产琥珀酸拟杆菌Bacteroides suis动物双歧杆菌Bifidobacterium animal婴儿双歧杆菌B ifidobacterium infantis嗜热性双歧杆菌Bifidobacterium thermophilum短乳杆菌Lactobacillus brevis干酪乳杆菌IactobaeiUS casei米曲霉As
33、pergillus oryzae迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus短少芽孢杆菌Bacillus pumilus嗜淀粉拟杆菌Bacteroides amylophilus栖瘤胃拟杆菌Bacteroides ruminocola青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum长双歧杆菌Bifidobacterium longum嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilum保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus纤维二糖乳杆菌IactobacillUS cellobiosus5
34、华南理工大学硕士学位论文续上表中英文名称弯曲乳杆菌 德氏乳杆菌Lactobacillus curvatus发酵乳杆菌Lactobac“Ius fermentum乳酸乳杆菌Lactobacillus lactis罗特氏乳杆菌Lactobacillus reuterii乳酸片球菌Pediococcus acidilacticii戊糖片球菌Pediococcus pentosaccus谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanii乳酪链球菌Streptococcus cremoris粪链球菌Streptococcus Faecalis乳酸链球菌Streptococcus lact
35、is酵母Y色astLactobaciIlus delbruekii瑞士乳杆菌LactobacilIus helveticus胚芽乳杆菌Lactobacillus plantarum肠膜明串株菌Leuconostoc mesenteroides啤酒片球菌Pediococcus cerevisiae(damnosus)费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae二乙酰乳酸链球菌Streptococcus diacetylactis中间链球菌Streptococcus intermedius嗜热链球菌Strept
36、ococcus thermophilus1222酵母西酵母细胞仅零星存在于动物肠道内。它是动物肠道内寄生的一类正常有益菌。酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶,具有增加饲料适口性,促进动物对饲料的消化吸收能力等功能。并可提高动物对磷的利用率“。近期研究表明,某些酵母菌可以通过刺激瘤胃微生物的生长与活性,提高纤维索的利用率,这一过程发生在瘤胃消化纤维的早期阶段。酵母菌还可以促进乳酸的利用,这一过程通过以下三条途径实现:直接吸收利用乳酸:利用可以被其他微生物转变成乳酸的糖:刺激其他微生物利用乳酸。酵母菌还能对微生物蛋白合成产生影响,由于酵母菌具有选择性地刺激瘤胃某些微生物菌群的能力,因而6第一
37、苹绪论影响到微生物合成蛋白质的质量(氨基酸的组成)m一“。酵母制剂有利于预防畜禽胃肠道疾病,改善动物机体的健康状况。酵母细胞壁具有与毒素和病原菌结合的能力,刺激机体的免疫机能,提高机体抵御外来病原微生物侵害的能力。这一部分的研究有待进一步深入探讨。I223芽孢杆菌芽孢杆菌是好氧菌,在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡,维持厌氧环境,增强肠道对厌氧菌的定植抗力。在肠道酸性环境中具有高度的稳定性,能分泌较强活性的胞外酶(如蛋白酶、淀粉酶和半纤维素水解酶),从而促进饲料营养物质的消化,提高饲料的利用率mm“。芽孢杆菌虽不是人和动物体内的正常菌群,但对人和动物不致病,将芽孢杆菌作为畜禽饲用的微生态
38、制剂已有十几年的历史。目前使用的菌株主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus sbtili s)、地衣芽孢杆菌(BaciUUS li chertiformis)、腊样芽孢杆菌(Bacillus cereug)和东洋芽孢杆菌(BacillUS toyoi)。1 224光合细菌光台细菌是一种能够利用光能进行生长的水生微生物,其营养十分丰富,其不仅蛋白质含量高,氨基酸组成齐全,而且还富含各种维生素、辅酶Q、抗病毒因子等多种生理活性物质。光合细菌作为饲料添加剂用于畜禽和水产业,除具有明显的增重效果,还具有一定的增色作用和增强机体抵抗能力的效果mI。目前研究较多的是红螺菌。13动物微生态制剂的防病促生长机制
39、I3。1对动物消化道微生态的调节13,11帮助建立和维持正常的肠道优势种群使用微生态制剂的目的在于通过补给优势菌株,与畜禽肠道内有益菌一起形成优势种群,维持正常微生态区系平衡。此外,在动物肠道非有益微生物区系建立前,给新生家畜、家禽饲喂益生菌有劝于畜禽建立正常的微生物区系,也能有效排除或控制潜在的病原菌“”。”。1。31。2通过生物夺氯方式阻止病原菌的繁殖微生态制剂中的需氧芽孢杆菌以孢子状态或其他活菌形式进入畜禽消化道后生长繁殖,消化肠道内氧气,使局部环境的氧分子浓度降低,造成厌氧环境,利用专性厌氧菌和兼性厌氧菌的定植和生长。使肠内微生物恢复平衡状态”“。7华南理_大学硕学位论文1313通过黏
40、附机制和竞争排斥作用阻止病原菌的繁殖某些益生菌通过与肠道中有害微生物的直接竞争和定居部位的竞争,可抑制病原菌微生物黏附或定植于肠道或占据病原微生物的附着部位,形成保护屏障,防止其直接黏附到动物细胞上,且自身一般不会脱落,从而发挥其竞争性抑制病原体在禽畜肠道的黏附或定植的作用m一。1314通过产生代谢产物和生理活性物质杀害病原微生物一些微生物在其发酵过程中,会产生生理活性物质,直接调节微生物区系,抑制病原菌。如有些乳酸杆菌和链球菌可产生嗜酸菌素、乳酸菌素等;芽孢杆菌可产生多肽类的细菌素,对大肠埃希菌和白痢沙门氏菌有显著的抑制作用。这些抗菌性物质通过改变肠道内活菌的数量而发挥作用2 S-2 D,。
41、有些微生物代谢产生的有机酸能降低动物肠道pH值,杀死不耐酸的病原菌。芽孢杆菌还能产生过氧化氢,杀害许多潜在的病原微生物。132为动物机体提供营养、促进生长1 321产生多种消化酶、提高饲料利用率芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性,还能降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物,释放出可被动物吸收的营养成分(2 2I。保加利亚乳杆菌在肠道内可增强B一半乳糖苷酶的活性m】。此外,益生菌还能诱导动物内源消化酶的分泌,提高饲料转化率ZoI。1322产生有机酸、促进营养物质吸收和激活酶原乳酸菌进入肠道内产生乳酸,降低肠道pH值,有利于铁、钙及维生素D等的吸收,激活蛋白酶,提高日粮养分的利用率,促进
42、生长101。一般而言,越小的家畜,消化酶对肠道pH值依赖性越强。1323菌体本身为动物提供营养许多益生菌其菌体本身就含有大量营养物质,如光合细菌富含蛋白质,还有多种维生素、钙、磷和多种微量元素等,可直接被动物摄取利用“。1324合成维生紊研究表明,畜禽动物肠道的微生物群均可合成维生素K、B族维生素、B一胡萝h素,并直接被动物吸收,从而加强动物的营养代谢m,。133增强动物免疫系统功能8第一章绪论益生菌可产生菲特异性免疫调节因子,提高机体的抗体水平,产生干扰素,提高免疫球蛋白浓度和巨嗜细胞的活性,增强机体免疫功能和抗病力。试验证实了双歧杆菌细胞壁中的完整肽聚糖可使小鼠腹腔巨噬细胞IL-l、IL一
43、6等细胞因子的mRNA的表达增多,从而在调节机体免疫反应中起到作用m,1331。乳杆菌能提高巨噬细胞的活性,并防止肿瘤的生长tmt。潘康成用地衣芽孢杆菌饲喂家兔,家兔的免疫器官的生长速度明显加快,而且血液中的白细胞总数和外周血T淋巴细胞酸性醋酸萘酯酶活性(ANAE)阳性率均显著高于对照组L 361。益生素的细胞壁上存在着肽聚糖,它通过激活黏膜免疫细胞而增加局部免疫抗体,增强抵抗有害微生物的能力371。134其他机制1341促进幼畜消化道发育和结构优化良好微生物菌群构成的微生态平衡对幼小动物消化道的正常结构与功能有积极的作用。研究发现,乳酸菌类益生菌有助于新生仔猪小肠绒毛的发育,促进断奶后仔猪肠
44、绒毛的再生与恢复”“。1 3。42防止有害物质的产生,改善环境动物微生态制剂的使用,可以加强肠内有益微生物的种群优势,抑制大肠杆菌的活动,扭转了大肠杆菌导致的蛋白质转化为氨和胺的倾向,具有除臭功能。微生态制剂还能防止动物肠道内有害菌产生的肠毒素、毒性胺、吲哚、甲烷等有毒物质的积累,有利于动物的健康“。14动物微生态制剂的应用及应用效果国内外动物微生态制剂的产品较多,在国外最有代表性的产品是日本学者比嘉照夫研制的EM微生物菌体制剂,由光合菌、酵母菌和乳酸菌等lO属80多种微生物复合培养成的有效微生物群。在国内,报道较多的活菌制剂方面有以单一菌种组成的产品九九一畜禽宝和DM423菌粉,以混合菌组成
45、的产品SEM科隆粉、磊菌宝、保得微生肠道调理剂等。九九一畜禽宝采用地衣芽孢杆菌制成,对鸡急慢性肠炎、鸡白痢及各种原因引起的肠道菌群失调症的治疗疗效确切。DM423菌粉由需氧腊样芽孢杆菌制成,用于各种畜禽腹泻性疾病的预防和治疗,不产生抗药性,有明显的促生长和提高饲料转化率的作用。SEM科隆粉富含38种微生物,粗蛋白和氨基酸含量分别高达62和53以上具有很高的酶活性。磊菌宝2则是一种能够高度降解粗纤维的活菌制剂。另外,市面上还有促康生、增菌素、抗痢宝、畜禽灵、光合细菌(PSR)、复方回春生(双歧杆菌制剂)、益菌王等产品,名目繁多,差不多覆盖了整个养殖业。9华南理一r大学硕士学位沧文动物微生态制剂在
46、养禽业、养猪业、水产养殖以及反刍动物养殖业中都取得良好的效果。表现在以下几方面:14I提高生产生能大量实验汪明,在鸡日粮中添加微生态制剂,能不同程度地提高肉鸡的生长速度及饲料转化率,蛋鸡的产蛋量,而且蛋黄的胆固醇含量明显下降,但对血液中酯类和胆固醇含量无影响【42”“”。饲喂微生态制刺可以使仔猪成活率提高45,并显著提高仔猪日增重和饲料利用率”61471。用酵母培养物、乳酸杆菌制剂可通过增加反刍动物瘤胃中纤维素分解菌的数量,分泌酶刺激纤维素在胃中的消化,从而提高增重、产奶量并改善乳的组成4Sl。142防病治病用腊样芽孢杆菌、枯草杆菌、乳酸菌和光合细菌对猪细菌性痢疾的研究均表明有一定疗效。王士长
47、等用微生态制剂防治肉鸡大肠杆菌病和沙!氏菌病的试验表明,添加微生态制剂组腹泻率和死亡率分别降低708和681【491。Pardue等试验发现,不论是把微生态制剂添加到雌鸡的F1粮中还是饮水中,均可使试验组的鸡白痢发病率下降30,而生长速度提高lO。143替代抗生素邢军等用960只12日龄罗曼蛋雌鸡进行为期33天的试验,比较了不同单一菌株、复合菌群以及抗生素药物的使用效果,结果表明,不论是曰增重、饲料转化率还是成本都比对照组有了明显的改善(4 3I。Grela比较了某微生态制剂(Velab)和阿伏霉素对仔猪的促生长作用,结果Velab处理组哺乳期仔猪体重比阿伏霉索处理组和对照组分别增重2和83【
48、50I。15影响动物微生态制剂的使用效果的因素151水分的影响一般来说,活菌制剂随着水分的升高,时间延长,微生物的存活率降低。不同细菌对水的耐受力明显不同,孢子型细菌耐受性最好,肠球菌、粪链球菌次之,乳杆菌再次之。酵母菌对水的耐受性较好。目前市场上很多微生态制剂已使用脱水剂,以延长保存时间。152外界因素的影响大部分活菌制剂都采用低温干燥工艺,因此保存要求环境温度较低,当储存温度超过304C时,制剂活性就会受到影喻,尤其是非孢子态微生物。第一苹绪论153氧化和抑菌物质大部分动物微生态制剂中的微生物菌株属于厌氧或兼性厌氧型,对氧气耐受性较差。某些抗生素、磺胺类药物以及不饱和脂肪酸、矿物质预混剂、浓缩料等都会使活菌活性降低。154保存时闻随着时间推移,活菌数不断减少,减少速度因微生物种类不同而异。以芽孢杆菌最为稳定,其次是肠球菌群中的粪肠球菌,再次是乳杆菌,稳定性最差的是双歧杆菌。155饲用方式与剂量同一使用剂量,饮水效果较好。156动物种类动物种类不同,要求益生菌组合也不同。适用于单胃动物的微生态制剂所用菌株一般为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等,而适于反刍动物的却是真菌、酵母菌等。157动物生理状态在研究仔猪生产性能时发现,仔猪处于外界环境变化等应激时期,益生菌能发生最佳作用,而当仔猪肠道微生物区系状况良好时益生菌的作用很小m