1、1,第八章 基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression曾海涛中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心,2,基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。,3,第一节 基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。,4,限制性核酸内切酶的特点类型 限制性
2、 修饰作用 识别位点 切割位点 型 有 有 特异 识别位点下游100到1000bp型 有 无 特异 可知、固定型 有 有 特异 识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。,5,2限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属co代表coli 种R代表RY13株,6,3限制性内切酶的识别和切割位点 通常是46个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3黏性末端（sticky end）。,如EcoR切割后产生5黏性末端：,5 -GAATTC-3 5 -G AATTC-3 3 -CTTAAG-5 3 -CTTAA G-5 ,7,Ps
3、t切割后产生3黏性末端：,有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）, 如Sma：,5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA G-3 3 -GACGTC-5 3 -G ACGTC-5 ,5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 3 -GGGCCC-5 3 -GGG CCC-5 ,8,二、其他常用的工具酶1. DNA聚合酶 (DNA polymerase I) 聚合酶活性 35核酸外切酶活性 53核酸外切酶活性,9,10,11,12,2. DNA聚合酶大片段(large fragment of DNA polymerase I)DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(sub
4、tilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。,53聚合酶活性 35核酸外切酶活性,无53核酸外切酶活性,13,Klenow片段的主要用途有：(1) 补齐双链DNA的3末端。,14,(2) 通过补齐3端，使3末端标记。5-G-OH Klenow 5-GTT*A*A-OH3-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3-CAA T T-OH(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。,15,3. 逆转录酶（reverse transcriptase）一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA， 合成方向为
5、53延伸，无35外切酶活性。,16,17,4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。,18,19,5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）能去除DNA或RNA 5端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。,20,21,6. 末端脱氧核苷酸转移酶 （terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT ),22,第二节 基因克隆的载体,载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制或表
6、达的DNA分子。,23,一、常用的克隆载体(一)质粒（plasmid）是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。,24,作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。,（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生素抗性基因， -半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。,（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便 于外源基因的插入。,25,26,27,28,质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。,29,(二)噬菌体噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。
7、噬菌体M13噬菌体,30,31,32,Ziplox载体,33,(三)黏性质粒（cosmid）是由噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达4050 kb。,34,(四) M13噬菌体 (M13 phage)一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。,35,36,(五) 病毒载体逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。,37,二、表达载体(一) 原核表达载体
8、表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号。,38,multiple cloning site,39,(二) 真核表达载体含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号.,40,第三节 基因克隆的基本过程基因克隆主要步骤： 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究,41,（二）从cDNA文库中获得,（三）PCR扩增特定基因,（四）人工合成,一、 目的基因的获得,
9、（一）从基因组文库中获得,42,几种常用克隆载体的比较,注：+表示可用；-表示不可用,比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体 克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb 基因组DNA文库 - + + - cDNA文库 + + - - 亚克隆 + - - + 序列分析 + + - + E.coli表达 + + - -,二、载体的选择与准备,43,三、DNA分子的体外连接,（一）黏性末端,（二）人工接头的使用,（三）加入同聚体尾,（四）平端连接,44,（一）黏性末端,45,（二）人工接头,46,（三）加入同聚体尾,待克隆DNA片段,重组质粒,混合、退火,空白质粒,47,（
10、四）平端连接,48,四、外源DNA导入宿主细胞（一）转化（transformation） （二）感染（infection）（三）转染（transfection）,49,五、目的基因的筛选和鉴定外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。,50,（一） 遗传学方法,插入灭活法,1.,51,2. 蓝-白筛选（互补）,许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序
11、列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。,52,53,（二） 免疫学方法如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。,54,（三） 核酸杂交法对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。,55,菌落原
12、位杂交的原理,转化 E. coli并铺于琼脂平板上,将膜放置 平板表面 定位、揭起,变性、 中和、 固定,杂交、 洗膜、 显影,56,（四） PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。,57,(五) 酶切鉴定用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。,58,第四节 真核细胞转染 一、真核细胞转染的方法与基本原理 （一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿
13、主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。,59,（二）电穿孔法（electroporation）将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。,60,（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法,外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。,61,（四）脂质体介导的基因导入,DNA,62,（五）显微注射法（microinjection）,63,二、 转染细胞的筛选(
14、 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP的合成有两条途径从头合成 可被氨基喋呤阻断补救合成 胸苷激酶(TK)是关键酶 TK+: 细胞生长 TK- 细胞导入含TK基因的载体: 细胞在HAT培养基生长,64,（二）药物筛选转染细胞新霉素抗性基因（neor）编码氨基糖苷磷酸转移酶，使氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）失活。G-418阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。,65,（一）寡核苷酸介导的定点诱变法,第五节 基因的改造,诱变引物,通用引物,Klenow片段，dNTP T4 DNA连接酶,转化大肠杆菌,标记诱变引物 原位分子杂交 放射自显影,66,（二）含U模板法,
15、67,（三）PCR介导的定点诱变法,68,第六节 克隆基因的表达,一、大肠杆菌表达系统 （一）基因表达的基本要素1. 目的基因 2载体的选择 3目的基因与载体的连接 4受体菌株和诱导条件,69,1目的基因 目的基因如果来自真核细胞必须是 cDNA 。 cDNA的始密码子（ATG）上游 部分（5端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。,70,2载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。,71,3目的基因与载体的连接 （1）起始密码子,（2）融合蛋白融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白
16、连接在一起。,72,4受体菌株和诱导条件 . 根据载体启动子选择菌株 . 确定诱导表达条件,73,（二）提高外源基因表达水平的措施1提高翻译水平（1）调整SD序列与ATG之间的距离 （2）用点突变的方法改变某些碱基（3）增加mRNA的稳定性,74,2使细菌的生长与外源基因的表达分开 将宿主菌的生长和外源基因的表达分成两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最为常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。,75,3提高表达蛋白的稳定性 （1）表达融合蛋白 （2）采用某种突变菌株 （3）表达分泌蛋白,76,二、哺乳动物细胞表达系统 在哺乳动物细胞中表达的基因，可以是基因组DNA，也可以是cDNA。先将基因重组到适当的真核表达载体中。重组的表达载体在大肠杆菌中进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化重组表达载体，然后将其导入哺乳动物细胞进行表达。,77,三、其他表达系统(一) 昆虫表达系统昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加工和修饰. 昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产.其生长速度快,不需要CO2培养箱,易于悬浮培养,可用于大规模表达蛋白质.,78,(二) 酵母表达系统酵母菌是一种单细胞真核生物,能进行翻译后加工和修饰.酵母菌在特定的培养基中生长迅速,与哺乳动物细胞相比,易于操作和价格便宜.酵母表达系统是大规模表达重组真核蛋白的理想工具.,79,谢谢！,80,
