1、1,第十二章 基因诊断 Gene Diagnosis,讲授：陈慧勇 分子生物学研究中心,2,基因诊断之父简悦威,1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例地中海贫血进行诊断。,第一节 基因诊断的技术和方法第二节 遗传病的基因诊断第三节 传染病的基因诊断第四节 肿瘤的基因诊断第五节 基因诊断法医学上应用,内容提要,4,第一节 基因诊断的技术和方法 （以遗传病诊断为例）,一、基因诊断的概念与特点,基因诊断：用分子生物学的理论和技术， 从基因或基因的表达产物水平来检测特定基因存在状态或缺陷，以对疾病作出诊断的过程。,5,遗传物质改变(诊断依据)： 一是基因或表达产物水平变化，
2、如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等； 二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。,6,基因诊断的特点高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用的广泛性,7,二、基因诊断的常用技术及应用举例,（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization,是指两条互补的单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。,8,1. Southern blot 的基本步骤：提取DNA 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段凝胶电泳分离 变性处理DNA转印到膜上并使其牢固结合将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂
3、交信号。,用于DNA的定性或定量检测,9,Northern印迹(Northern blot)杂交用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。Northern blot 的步骤：RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。,10,斑点杂交(dot blot hybridization),将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量的研究。,11,正常的（N）的： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（M）的： 5-ACT CCT GT
4、G GAG AAG TCT GC-3,镰状红细胞贫血病基因诊断举例：,P322,12,正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3,镰状红细胞贫血患者基因组的ASO杂交法检测,P322,13,Allele Specific Oligonucleotide （ASO） 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。,14,斑点杂交,镰状红细胞贫血患者基因组的ASO杂交法检测,A,
5、B,C,A,B,C,N-ASO,M-ASO,15,反向斑点印迹杂交 (reverse dot blot hybridization) 探针先固定于膜上。用一张含有多种特异性寡核苷酸探针的膜与待测目的基因杂交，经过一次杂交便可同时筛查出被检DNA中的多种突变。,16,举例：-地贫的反相斑点杂交分析,P323,17,核酸分子杂交的流程,制备样品,制备探针,杂交,检测,18,（二） 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction（PCR）,模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP Mg2+,降温,升温,升温,1. PCR原理,19,一对引物：正向和反向 限制了PCR扩增的片段的
6、范围,多重PCR,20,2. PCR在基因诊断中的应用,荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP,21,ASO1,ASO2,N,H,M,PCR-ASO,P323,22,AS-PCR（allele specific PCR） 等位基因特异PCR：根据引物3端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物,P323,23,（三）单链构象多态性分析（ Single-strand conformation polymorphism，SSCP）,DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同单链构象多态性
7、（Single strand conformation polymorphism，SSCP），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。,24,PCR-SSCP分析原理示意,25,正常人,纯合突变,杂合突变,+,举例：PCR-SSCP分析,26,（四） 限制性片段长度多态性分析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）,由于DNA 变异产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点，导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR的方法进行检测。,27,GAATTC,CTTAAG,EcoR 限制性内切酶位点的
8、变化,28,镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析,Mst酶切位点（CCTNAGG）,举例：,29,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析,P322,30,PCR-RFLP设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。,31,举例：HBS的PCR-限制性内切酶谱分析,正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段，而患者扩增的DNA片段不被酶切，仍为110bp，3为镰状细胞贫血症HbS杂合体。,P322,32
9、,（五） DNA序列测定（DNA sequencing）,33,病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(GT)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A,例：序列分析用于基因诊断研究,34,表12-2 基因诊断中常用的分子生物学方法比较,35,36,三、 基因诊断技术路线与方法,根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常 间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析,37,（一）直接诊断途径,1. 必要条件： 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被
10、检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知,38,RFLP,2. 点突变的检测： （1）导致特异性限制性内切酶位点改变,39,（2）无限制性酶切位点改变 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序,40,举例：-地贫的PCR-RE（直接诊断）,PCR-RE分析 MaeI CAAG CTAG,1： 未酶解片段； 2： A /A； 3： A /T； 4：T /T 注：由于54bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在0.8%的琼脂糖凝胶中不易被观察到。,P317,41,在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括
11、大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等,3. 基因重排 的检测：,核酸分子探针杂交与PCR,42,举例： 地中海贫血的直接基因诊断,基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。,P290练习,1,2,+, + +,0, + 0, 0 0,43,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,举例： 地中海贫血的直接基因诊断,基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。,P290练习,44,Southern blot 检测结果：,/ /- /- - - /- - - - /
12、- -正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,举例： 地中海贫血的直接基因诊断,45,4. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析,46,M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。,举例：前列腺癌标记基因DD3PCA3表达相对定量检测,47,（二）、间接诊断途径,1、采用原因： 致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机理不清 致病位点不便检测,48,2. 遗传标记DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存
13、在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系,49,A,a,a,a,A,A,A,A：某一未知基因 B：某一已知遗传标记,B,b,b,b,B,B,B,50,RFLP 标记的连锁分析,7.6kb,13kb,患病,正常,R2=0.8-0.9,举例：镰状红细胞贫病的间接基因诊断,Hpa,P320,51,基因诊断的其它应用举例,甲流病毒颗粒,6个具有北美猪、禽和人三种基因来源；另2个具欧亚猪源。目前基因诊断： RT-PCR,52,英国三姐妹一起割乳预防癌症,BRCA基因突变与乳腺癌的易感性有关，所以可以通过对该基因一些突变位点的检测来预测患病的风险性。,53,第五节 基因诊断在法医学上的应用,54,DNA指纹分析用于个体鉴定,P338,55,目的要求,掌握： 基因诊断的概念及其特点；镰状细胞贫血病的基因诊断技术（限制性酶切图谱分析和PCR分析）。熟悉：基因诊断技术路线和方法的选择，-地中海贫血症的基因诊断。,56,T,13kb,患病,正常,综合练习：HBS的基因诊断,A,7.6kb,Hpa:,1.15kb,1.35kb,Mst：,57,THE END,THANK YOU,
