1、Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA 合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护：加入 Deblocking 脱去碱基上 5- OH 的保护基团 DMT，获得游离的 5- OH； (2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基 5-OH 仍然被 DMT 保护，3端被活化与溶液中游离的 5-OH 发生耦合反应；(3) 封闭：耦合反应中极少数 5- OH 没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2
2、.引物合成后如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解 CPG 与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的 3羟基。纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE 和 HPLC。定量：根据寡核苷酸在 260nm 处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。Q3.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用 引物长度要求 纯度级别要求一般 PCR 扩增 60 base PAGE诊断 PCR 扩增 40base HEPD, PAGEDNA 测序 20base 左右 HEPD亚克隆，
3、点突变等 根据实验要求定 HEPD, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 HEPDPAGE反义核酸 根据实验要求定 HEPDPAGE修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLCQ4.引物的质量是不是跟序列有关？四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属 GC 重复多的和序列中还有多个连续的 G 的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了 20 个 G 以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续 G 的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC 和 PAGE 方法都无效。鼎国昌盛生物公司拥有的 HEPD
4、专利技术能够克服高 GC 或者高 G 含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高 GC 引物和无论长短的 oligo d（G）都能得到同样的非常好的结果。Q5.需要合成多少 OD 数？根据实验目的确定。一般 PCR 扩增，2 OD 引物，可以做 500-1000 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD 就足够了。Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成 10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方
5、式计算：V (微升)= OD 数 x 33 x 10000 /引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。Q7.如何计算引物的 Tm 值？引物设计软件都可以给出 Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。长度为 25base 以下的引物，Tm 计算公式为：Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm 计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (GC%) 600/size公式中，Size =引物长度。Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的分子量（MW）
6、在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5，引物的分子量 =碱基数 x 碱基的平均分子量，或按下列公式计算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns62.NA, NG, NC, NT, NI 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量，WA, WG ,WC, WT, WI 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量
7、。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns 为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16。常规碱基分子量Base Molecular WeightA 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17常规修饰基团分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.605-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.495-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.465-TET 675.24 3-Amino Modifier C3
8、 153.075-Cy5 533.63 3-Amino Modifier C7 209.185-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.12Q9.如何溶解引物？干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。Q10.如何保存引物？引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。干 粉
9、：运输时常温运输， -20可以保存一年。储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20可以保存半年。工作液：常规使用，4保存，也可-20 保存，但应避免反复冻融。修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。Q11.最长可以合成多长的引物？我们合成过 100base 的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于 80base 的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自
10、然低于一般的引物。修饰引物通常需要 PAGE 或 HPLC 纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的 5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA 分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。Q14.为什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5？需要指出的是 OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。 OD260/OD280
11、的比值过低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 20base 同聚体引物的OD260/OD280 的比值，清楚表明 OD260/OD280 的比值与引物的碱基组成密切相关。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase Composition A260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
12、 1.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66Q15.同样的 OD 用 PAGE 检测，EB 染色为什么深浅不一？通常可以用 EB 染色的方法来判断双链 DNA 的量( 如质粒 DNA)，因为 EB 可以嵌合到双链DNA 中。而合成的单链 DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB 的染色程度也会有差异，比如 Oligo(dT)等不形成二级结构，EB 染色效果就非常差。所以不要用 EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。Q16.如何检测引物的纯度？实验室方便的做法是用 PAGE 方法。使用加有 7M 尿素的 16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取 0.2
13、-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95,2mins) 。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约 2-3 小时)，剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？如果您溶解引物的水 pH 过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用 10mM Tris pH7.5 缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是 PCR 使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
