1、免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G“特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的 FC 片段的 现象开发出来的方法。目前多用 protein A/G 预先结合在 argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A/G 就能达到吸附抗原的目的。通 过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同 时由于在非变性条件下 进行实验，所以要得到一个完美的 实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对 免疫沉淀
2、体系也需要有严 格的控制指标。免疫沉淀 实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads 孵育；抗体-agarose beads 复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者 4裂解 30min， 12,000g 离心30 min 后取上清；(2) 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液将 1g 相应的抗体和 10-50 l protein A/G-beads 加入到细胞裂解液，4C 缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在 4C 以 3,000 g 速度离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心至管
3、底；将上清小心吸去，protein A/G-beads 用 1ml 裂解缓冲液洗 34 次；最后加入 15l 的 2SDS 加样缓冲液，沸水煮 10 分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting 或进行质谱分析。一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步 处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的 质量决定了抗原抗体反应 中的抗原的质量， 浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后 续的抗体-agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者 4完
4、成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的 RIPA 裂解液为例（主要含有 pH7.4 左右的离子 缓冲液，接近生理浓度下的 NaCl，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途， 进而帮助我们如何 针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a缓冲液：离子 缓冲液常采用 pH7.4 的 Hepes 或者 Tris-Cl。b NaCl 浓度一般习惯用 150 mM，这主要是因为 150 mM 接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的 NaCl 浓 度并不是均一的，局部 N
5、aCl 的浓度可以低到 50 mM，150 mM 的 NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的 NaCl 浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c甘油由于其粘性，可以 对蛋白 质之间的相互作用起到一个很好的保 护作用。一般添加 10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d裂解液中的去垢剂可以裂解 细胞质膜，也同 时破坏了许 多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验 的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改 变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂
6、对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加 EDTA 抑制金属蛋白酶，通过 Protease Cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e去垢剂对于免疫沉淀 实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象 对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对 不
7、同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢 剂适应 作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。二、抗体-agarose beads 孵育裂解细胞，离心并去除不可溶的膜 组份后，上清可以 储存在 -80保存 3 个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads 孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A 或者 G beads 孵育过 夜，也可以同 时加入抗体和 Protein A 或者 G beads 孵育过
8、夜。一般选择 1mg 总蛋白（1mg/ml）对应添加 1 ug 抗体，最高可以添加至 5 ug 抗体，过多的抗体会产生假阳性。 这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般 选用加同样量的 IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白 A 的免疫沉淀，选择膜蛋白 B 来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白 C 的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白 D 来做阴性对照。同 时，为避免 Protein A 或者 G beads 有（非）特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein A 或者
9、 G beads 与细胞裂解液孵育数小 时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads 孵育。同时，Protein A 或者 G beads 对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和 Ig 亚型， 选择合适的Protein A 或者 G beads 也是决定免疫沉淀 实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用 Protein A 和 Protein G beads 的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。三、抗体-agarose beads 复合物洗 涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose
10、 beads 复合物进行多次洗涤。一般洗 涤缓冲液使用和裂解液一 样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。 针对不同的实验要求， 还可以通 过更改 NaCl 的浓度以及去垢剂的比例，种 类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比 较牢靠，可以考 虑使用低浓 度（0.2-0.5% ）的 SDS 洗涤抗体-agarose beads 复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛（见 IP： Q过表达提高目的蛋白的含量；选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的样品进行
11、免疫共沉淀实验抗体浓度过高 降低抗体作用浓度假阳性太大,有太多非特异性相互作用蛋白被检测到 抗体特异性不好 更换抗体染色质免疫沉淀产生的问题 产生问题的原因 解决办法 备注染色体片段太小 超声（X-CHIP）或者酶解（N-CHIP）片段不要小于 500bp 过度交联 严格按照 protocol 进行操作，多聚甲醛交联时间控制在 10-15 min多度交联会导致更多的抗原表位被破坏，影响抗体与目的蛋白的结合实验的染色体量不够 不要少于 25ug 使用 N-CHIP 方法去进行实验当目的蛋白和 DNA 片段之间的相互作用比较弱时改用 X-CHIP方法组蛋白与 DNA 片段之间的作用比较强，可以使用 N-CHIP方法使用了不合适的单抗 使用多抗或者单克隆抗体群或者更换合适的单抗多聚甲醛交联会破坏许多抗原表位使得某些单抗的作用效果会减弱目的蛋白没有与待测DNA 片段结合使用阳性对照判断 CHIP 实验是否成功 没有检测到与目的蛋白相互作用的 DMA 片段或者检测到的信号太弱PCR 实验失败（引物设计不合理或者 PCR 反应条件不佳）重新设计引物或者摸索最佳 PCR条件抗体浓度过高 降低抗体作用浓度 抗体特异性不好 更换抗体 假阳性太大,有太多非特异性结合 DNA 片段被检测到PCR 污染 重新配置 PCR 缓冲液
