1、液相色谱基础知识08年12月,一、色谱起源,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用,液相色谱基础知识,HPLC的分离类型,正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode),液相色谱按两相极性不同分为: 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序,正相HPLC色谱柱,硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析二醇基
2、型 蛋白质分析,Silica gel,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),Modified Si,反相HPLC色谱柱,C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type,-Si-C18H37,Si,Non-polar property,色谱柱 : 非极性 溶剂 : 极性水 / 甲醇 / 乙腈,反 相 色 谱,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,流动相,流动
3、相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 流动相配制时的顺序,溶 剂 等 级,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,水 / MeOH梯度ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,溶 剂 等 级,鬼峰的出现,溶 剂 等 级,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,
4、都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒),优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.22um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,溶 剂 等 级,溶剂前处理-过滤,过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类水系过滤膜有机系过滤膜,30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，
5、由0.22m和0.45m两种规格,材料为纤维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。,样品过滤头的类型：,滤膜类型：,聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。,溶剂前处理-脱气,目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能
6、容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：1）柱压波动，流量偏小2）基线波动,流路中形成气泡引起的问题,改变保留时间和峰面积 流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动 峰变形 柱中气泡形成和累积使流动相绕流 尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声,常用脱气方法,超声脱气减压脱气在线脱气氦气脱气,输液泵,输液泵控制方式：恒流控制恒压控制,输液泵类型：注射泵柱塞往复泵隔膜泵,柱塞往复泵,柱塞往复泵,优点 压力脉动小 易于更换溶剂 缺点 需要更换柱塞杆密封圈,岛津VP系列输液泵,目的 单元 流速范围 特性和应用,分析 LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于
7、 半微量LC 和 LC-MS,LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性，适于常量分析,*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度,等度洗脱,梯度洗脱,分析时间长,分离度差,MeOH / H2O = 6 / 4,MeOH / H2O = 8 / 2,( column : ODS type ),等度洗脱,95%,30%,MeOH 浓度,梯度洗脱,梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使
8、用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,混合器,低压梯度比例阀,高压梯度,低压梯度,脱气机,高压/低压梯度系统,返回,高压梯度系统 梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵) 低压梯度系统 系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应,高压/低压梯度系统,进样器,自动进样器 手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入,返回,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,返回,手动进样要点,进样量：要么小于定量环体积的一半，要么满刻度进样（需要推进3-5倍定量环体积的样品） 进样动作：在load状态推针，动作要平缓，以防样品冲出，进样后先切换到injeck状态，在拔针，
9、以防倒吸产生气泡。 用进样针吸取样品溶液后，必须将气泡排除方可进针。 清洗：在injeck状态清洗进样口。 废液口：废液管的出口末端应与进样口水平，以防样品倒流泄露或产生虹吸。,手动进样器,操作注意点： 1）进样时，进样针应插到底 2）不使用时将针头留在进样器内 3）进样应使用液相色谱专用平头进样针 4）清洗应使用专用针口清洗器,清洗针口,柱温箱,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,色谱柱（反相）的使用维护,避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 在阀进样时阀的转动不能过缓 。 在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流速下（0.2-0.3/min）冲洗30min，长时间未用的分析
10、柱也要同样处理。 定期使用强溶剂冲洗色谱柱。 使用缓冲盐时，要先用含5%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。 要净化样品 不使用时，要盖上柱子，避免固定相干涸。 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏,色谱柱,1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40左右，最高使用温度为50 3）流动相PH使用范围为27.5 4）流动相有机溶剂比例过低，柱效下降快，应避免使用纯水直接冲洗柱子,ODS（C18）柱的使用注意点：,流动相注意点,离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用,LC检测器,紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）,紫外可见检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，AKCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,紫外可见检测器,紫外可见检测器,液相启动后的注意事项,漏液检查泵的压力检查基线检验定期清洗溶剂贮存瓶,
