蛋白质组学及其相关技术研究概况.ppt

1、蛋白质组学及其相关技术研究概况,更多核磁资料,请下载核磁共振小助手，sina下载地址： http:/ 二、蛋白质组学的研究内容 三、蛋白质组学研究的相关技术 四、蛋白质组学研究的应用 五、蛋白质组学研究中的困难,一、产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。 2. 随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 3. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 4. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。,5. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态

2、。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。6. 蛋白质组与蛋白质组学 （1）蛋白质组：1994年提出，最早见于文献是1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。指基因组表达的所有相应的蛋白质，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。 （2）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学。,7. 蛋白质组具有多样性和可变性的特点 （1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。 （2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。 （3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。,二、蛋白质组学的研究内

3、容 细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学） ： 关键技术：2-D电泳 2. 蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。 3. 蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。 4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用,三、蛋白质组研究的相关技术 （一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳1. 1975年，Patrick OFarrel发明了二维凝胶电泳。2.

4、 操作（1）等电聚焦 （2）平衡胶条 （3）第二相SDS-PAGE,3. 2-D胶上蛋白质鉴定 （1）早期Western blot鉴定 （2）Edman降解法鉴定 （3）肽质量指纹（peptide-mass fingerprinting）技术鉴定 （4）蛋白质组信息学,2D 電泳 Mass 定序分析,（二）构象解析技术 1. 实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。 （1）局限性 （2）改进措施：已经运用原子力显微镜及多功能光学诊断技术深入研究蛋白质晶体生长的机理

5、；高能量光源的使用。 2. 通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构 （1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 （2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。,（三）蛋白质序列测定1. 蛋白质直接测序的用途2. 肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解,蛋白质测序发展简史 1. 英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。 2. 建立色谱技术和定量氨基酸分析

6、技术（ 20世纪50年代）。 3. Edman降解（20世纪70年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。 4. 20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。,5. 对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。 6. 毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术

7、）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。,7. 蛋白质C端测序： C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。 （1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。 （2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8

8、个残基的C端顺序测定。,8. 质谱法用于蛋白质顺序测定： （1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。 （2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。,（3）20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。 电喷雾质谱测定分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质

9、联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。,9. 质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋白质分析方法。通常是联合运用这些技术。 10. 蛋白质测序展望： （1）N 端测序仪在灵敏度上还需提高。 （2）C端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。 （3）

10、质谱技术将有令人刮目相看的作为。 （4）一些新的分析技术很可能进入蛋白质顺序分析领域，如多维核磁共振方法。,（四）研究蛋白质胞内分布及移位的方法 1. 研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内蛋白质，然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。不能采用离心的方法获取各组分蛋白，而用顺序抽提亚细胞结构的方法。 2. 将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下进行观察蛋白质移位。（五）研究蛋白质功能模式的技术酵母双杂交系统、选择性噬菌体感染技术、质谱技术可用于确定蛋白质作用区域。,四、蛋白质组学研究的应用 1. 用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。 2. 用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的

11、致病机理并寻找全新的药物作用靶点。 3. 蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。 4. 对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。 5. 追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导途径中的位置。,五、蛋白质组学研究中的困难 1. 2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不能被显示。 2. 2-D胶上显示的蛋白质有偏向性。 3. 难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在2-D胶上显示。 4. 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。,核磁共振资料下载+核磁企业网站,更多核磁共振资料，请下载核磁共振小助手，百度网盘下载地址： http:/