1、 附录 XX 单抗纯度测定方法 -CE-SDS 毛细管电泳（还原和非还原） 本法系采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳（ CE-SDS）紫外检测方法，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，定量测定重组单抗产品的纯度。 参 照毛细管电泳法（附录 V G）测定 。 1. 毛细管电泳系统 （ 1）检测器：紫外检测器，波长： 214 nm。 （ 2）毛细管：非涂层 -熔融石英毛细管（内径 50 m），切割至总长为 31 cm、有效长度为 21 cm。 （ 3）孔塞大小 : 8 (100 800 m) 2. 试剂 （ 1） SDS样品缓冲液：含 1% SDS的 0.1M Tris-HCl溶液 , pH 9.0。
2、 （ 2） SDS 凝胶 分离缓冲液：含 0.2% SDS的缓冲液（ pH8.0），含有适当的亲水性聚合物作为分子筛。 （ 3） 0.1 N盐酸 溶液 （ 4） 0.1 N氢氧化钠 溶液 （ 5） 纯的 2-巯基乙醇 （ 6）烷基化溶液： 0.8 M的碘乙酰胺水溶液 , 如称取约 74 mg 碘乙酰胺，加入 500L超纯水溶解，新鲜制备，避免光照。 （ 7）参比品 溶液：终浓度 1 mg/mL。 3. 供试品 处理： （ 1） 供试品溶液制备 ：用 SDS样品缓冲液 将供试品 稀释至 1mg/mL。样品 缓冲液以相同稀释倍数稀释， 为空白 对照 。 （ 2）非还原 供试品 溶液制备：取 供试品
3、溶液 （ 1mg/ml） 95L，加入 0.8 M碘乙酰胺水溶液 5 L ，涡旋混匀。取空白 对照 95L，加入 0.8 M碘乙酰胺水溶液 5 L，涡旋混匀 ，为 非还原空白 对照 。 （ 3）还原 供试品 溶液制备： 取 供试品溶液 （ 1mg/ml） 95L，加入 2-巯基乙醇溶液 5 L ，涡旋混匀。取空白试剂 95L，加入 2-巯基乙醇溶液 5 L ，涡旋 混匀 ，为 还原空白 对照 。 将 供试品溶液 和空白 对照 在 68C -7 2C孵育，非还原 供试品溶液 孵育 5min，还原 供试品溶液 孵育 15min 。冷却到室温后 6,000 转 /分 离心 1分钟 。 从样品管中分别
4、取出 75L至样品瓶中，立即进行分析。 4. 样品分析 毛细管的预处理 : 0.1 N氢氧化钠 溶液 在 60 psi压力下冲洗 3分钟，然后用 0.1 N 盐酸溶液 在 60 psi压力 下冲洗 2分钟，最后 用 纯水 在 70 psi压力 下冲洗 1分钟。 每次运行前应进行。 毛细管的预填充： SDS 凝胶 分离缓冲液在 50 psi压力 下冲洗 15分钟。 每次运行前应进行。 样品进样： 10kV反相极性电动进样。还原样品进样 30 秒；非还原样品进样40秒。 分离： 15 kV 下运行 40分钟，反相极性。 样品室温度： 18C -22C 毛细管温度： 18C -22C 进样顺序：参比
5、品、样品、参比品、空白。 5. 系统适应性 （ 1）还原条件的系统适应性要求： 电泳图谱： 参比品 溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度：糖基化重链和非糖基化重链能够明显的分辨（分离度根据实际测定数据设定）。 参比品非糖基化重链占总重链的百分比：以非糖基化重链的修正峰面积占总重链的修正峰面积的百分比计算。 参比品 溶液中非糖基化重链占总重链的百分比应在指定范围内（根据实际测定数据设定）。 迁移时间：两针参比品重链迁移时间差 1.0分。 空白：空白溶液中应无干扰峰。 （ 2）非还原条件的系统适应性要求： 电泳图谱： 参比品 溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度：
6、IgG主峰与片段的分离度根据实际测定数据设定。 参比品主峰百分比：以主峰的修正峰面积占总修正峰面积的百分比计算。系统适应性溶液主峰的相对百分含量 应在指定范围内。 迁移时间：两针参比品主峰的迁移时间差 1.0 分。 注：根据仪器的不同，可调节样品进样时的条件和毛细管种类以满足系统适应性要求。 6. 样品结果分析： 还原条件：按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的修正峰面积分别占所有修正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的纯度，三者之和即为产品纯度。 注：根据样品功能决定是否包含非糖基化重链纯度 非还原条件：按面积归一化法计算，以 IgG主峰的修正峰面积占所有修正峰面积之和的百分比计算主峰的纯度。
