1、实验六 菌落的 PCR 鉴定【实验目的】通过本实验学习菌落 PCR 的基本原理与实验技术。【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落 PCR 方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为 PCR 扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。【实验步骤】 用 200 L 的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于 15 L 无菌水中，吹打混匀，从中取 2L 菌液作为菌落 PCR 模板。1在 200 l PCR 管内配制 20 l 反应体系：反应物 体积/L模板 DNA 2.0灭菌蒸馏水（ddH2O) 10.310P
2、CR 缓冲液 2.0dNTP （2.5mM） 1.6引物 1 （2M） 2.0引物 2 （2M） 2.0rTaq 酶 （1.0 单位） 0.1Total 20 2. 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm 离心 15 sec 使反应成分集于管底。3. PCR 反应热循环程序设置： 94 预变性 3 min; 94 变性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 3 min; 16 pause反应结束后短暂离心，置 4 保存备用。配制 1的琼脂糖凝胶。4.取 5L PCR 产物加 1L 6loading buffer 于 1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的 13 L 菌液置 4 保存备用。【结果与分析】 本实验扩增片段长 652 bp。由图可知，1、4 泳道没有条带，说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染，使 T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。而2、3 号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中，所得片段大小符合目的片段。1 2 3 4
