1、总 RNA 提取试剂RNAtrip货号：M090159RNAtrip 成功避开各种商业 RNA 提取试剂盒的种种弊端，采用最新技术和工艺，在提取过程中既能有效裂解组织细胞，强烈抑制 RNA 酶活性保护 RNA 免受降解，同时极为有效地分离去除 DNA 和蛋白质。RNAtrip 使 RNA 分离如同提取质粒 DNA 一样简单可靠，可在 30-60 分钟内完成，获得极高纯度的总 RNA 沉淀，可用于 RT-PCR、Northern Blot、RNA 酶保护、Poly(A) mRNA 纯化、体外翻译等实验。储存: 4 oC 密封避光保存两年以上有效。然而因疏忽或冰箱意外停电，RNAtrip密封避光存
2、放于 25 oC 室温数个月，品质不受影响。适用: (1) 固体组织 (100 mg /ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。(2) 培养细胞 (510 106 细胞/ml): 真核细胞，细菌，酵母。(3) 液体标本 (100 l/ml): 全血、体液、尿液，病毒样品等。用户实验用品和操作准备极微量的 RNA 酶都会导致 RNA 降解。分离 RNA 时 RNA 酶污染主要来自以下五个方面：(1) 来自实验人员的双手。(2) 来自器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源 RNA 酶。(4) RNA 未能完全与蛋白质分离。(5) RNA 沉淀和溶解时来自吸头离心
3、管和溶液。我们的 Step by Step 质量监测表明，RNAtrip 可 100抑制 RNA 酶活性，并在分离步骤完全清除 RNA 酶。因此在有 RNAtrip 存在的步骤中，使用高压消毒 20 分钟的吸头离心管和溶液即可胜任 RNA 提取操作。然而在 RNA 溶解之后，来自实验材料的 RNA 酶污染将会导致 RNA 降解，应严格使用高压灭活 RNA 酶的用品。戴手套无疑是有益的，但戴口罩和帽子则无必要。只要严格按照本指南进行准备和操作，使用RNAtrip 总是能获得高纯度 RNA。1. 固体组织破碎设备。准备下列装置之一，1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁，用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵
4、。适用于液氮冻存组织的研磨，清洗同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装满蒸馏水的试管或烧杯中，开启超声清洗探头 30 秒至 1 分钟。4)高速机械匀浆器(Polytron，Tekmar 或类似产品)。打开开关，在蒸馏水中清洗分散器头数次。对这些装置的部分部件高压消毒 30 分钟是保险的措施，但使用 RNAtrip 这种处理并不必要。2. 高压蒸汽 30 分钟消毒一次性吸头离心管。RNA 沉淀和溶解之后，应严格使用高压消毒的一次性用品。然而 RNAtrip 能在 RNA 酶污染环境下工作，在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管，但仅推荐在紧急情况下这样做。比如由于不可预测的
5、原因，动物已经处死，组织已取出，细胞已收取，而吸头和离心管尚未高压处理。 这仅仅适用于 RNAtrip 试剂，对其它来源 RNA 提取试剂无效 。此时保险做法是使用普利莱基因技术公司的另种产品组织 RNA 保护液(Cat# R1030)，用户可把来不及处理的标本保存在RNA 保护液中，37 oC 保存 3 天，25 oC 保存 2 周，4 oC 保存 4 周，20 oC保存数月，固体或液体标本中 RNA 不会降解。3. DEPC 处理的双蒸水。加 DEPC 到水中至终浓度为 0.01% v/v，室温过夜，高压消毒 30 分钟。用于溶解 RNA，配制 TE 缓冲液和 75乙醇。普通双蒸水，高压消
6、毒 30 分钟，用于冲洗器皿，配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌，但琼脂糖不能高压处理。异丙醇，氯仿，纯乙醇，分析纯。电泳槽，双蒸水冲洗。离心机和加样器，无需处理。4. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少 RNA 降解。5. 戴手套。提取质粒 DNA 使用大量 RNA 酶，为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。RNA 提取程序 1. 组织细胞破碎与裂解冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使 RNA 得率下降，还将导致 DNA 和蛋白质污染。在紧急情况下，如动物已处死，组织已取出，细胞已收取，异地取送标本，用户尚未做好实验准备时，推荐用户把组织细胞储存在 R
7、NA 保护液(Cat# R1020)中，保证标本中的 RNA 不降解。(1) 固体组织。按比例每 50-100 mg 组织加 1 ml RNAtrip 试剂。用研钵研磨(仅适用于液氮冻存组织)：组织放在研钵中研成粉末，加 1 ml RNAtrip 试剂，继续研磨至组织完全裂解。用玻璃匀浆器匀浆：加入 RNAtrip 上下手动匀浆组织 10-15 次。用高速机械匀浆器：将组织放入塑料试管内，试管置冰浴烧杯中，加入RNAtrip 试剂，将分散器头垂直插入管内与组织块接触，转速 12,000-20,000 rpm，上下移动试管 10-20 次，直到组织完全打散，无肉眼可见大块。用超声仪：需根据机器型
8、号进行预试验，选取有效破碎组织的功率和时间。注意： (1)通常用 50-100 mg 组织可获得足量的 RNA，对绝大多数实验目的绰绰有余。加入过量组织或过少 RNAtrip 容易导致提取失败。 (2)少量难以打碎的组织碎片不影响后续 RNA 提取。 (3)用研钵和玻璃匀浆器匀浆破碎组织时，应略微多加一些裂解液，以补充裂解产物粘在容器壁上造成的体积丢失。(2) 培养细胞。贴壁细胞：弃培养基，用 PBS 缓冲液冲洗细胞一次。每 5-10106 个细胞加 1 ml RNAtrip 试剂，但 RNAtrip 加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个 75 cm2 瓶皿的细胞通常需要 2 ml 提取液
9、，一个 35 cm2 瓶皿的细胞需要 1 ml 提取液，更小的培养瓶皿可使用更少的提取液，但后续操作会因体积过小而极为不便。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上 5 分钟，倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。悬浮细胞：低速离心收集细胞，将细胞快速重悬于 50-100l 的 PBS 或去离子水中，每 5-10106 细胞加 1 ml RNAtrip 裂解。注意直接裂解未重悬的细胞沉淀，裂解物将十分粘稠而难以分散。细菌酵母：离心收集沉淀，加入 50-100l 去离子水重悬细胞。每107 细胞加入 1-2 ml RNAtrip 直接裂解。某些细菌和酵母细胞可能需要匀浆破碎。(3)
10、液体标本：如体液、尿液、全血。每 100l 液体样品加 1 ml RNAtrip，置冰上 1-3 分钟。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。RNAtrip Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本 RNA 提取。2. 将组织细胞裂解物转移到 1.5 ml 离心管，置冰上 10 分钟。 优化步骤：如果组织裂解物含较多的碎片，或提取植物组织， 12,000g 4 oC 离心 10 分钟，取上层裂解液，弃管底碎片和粘稠 DNA。如果提取脂肪组织， 12,000g 4 oC 离心 10 分钟，小心吸掉最上面的油层，弃去。再取裂解液，弃管底碎片和粘稠 DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。
11、3. 加入 0.2 体积的氯仿 (0.2ml)，充分颠倒混匀，冰浴 5 分钟，溶液分相。有时分相不明显，不影响提取。4. 12,000 g 4 oC 离心 10 分钟，溶液分为两相。RNA 在上层水相，下层为有机相，两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出 0.5ml上层水相转移到新离心管。 注意：取上清液时应保留 0.5-1 mm 厚的水相，以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入，应将所取的上清液放回管中并重新离心 10 分钟，再次吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易导致 RNA降解和 DNA 污染。如需同时提取 DNA 或蛋白质，则保留中间相和下层有机相，向公司索
12、要操作方法。5. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于上清液充分混匀。冰上孵育 10 分钟沉淀 RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。如果起始组织细胞的量很少，20 oC 放置一至数小时可沉淀几乎所有的 RNA。注意：从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取 RNA 时，按以下步骤进行：以每 1 ml RNAtrip 裂解组织，加氯仿后离心得到约 0.5 ml 上清液计算，分别加入上清液一半体积即 0.25 ml 的高盐溶液 (0.8 M 柠檬酸钠和 1.2 M NaCl)和 0.25 ml 异丙醇，混匀。执行下面的离心沉淀步骤 6。离心后可有效沉淀 RNA，但多糖或糖原存留在
13、上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取 RNA 时，推荐使用植物 RNA 分离试剂 Plant RNAtrip 或 Plant RNA Extraction Kit。6. 12,000 g，4 oC 离心 10 分钟。管底可见少许 RNA 沉淀。 注意：如初始组织细胞量少， RNA 将附着在管壁，用肉眼几乎难辨沉淀，但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状，通常表明有蛋白污染。应仔细检查操作步骤。7. 弃上清。立即加入 1 ml 75%乙醇，颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 g 离心5 分钟。弃上清，尽量完全吸去管壁上的液体。 注意：乙醇洗涤后 RNA 沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸
14、走 RNA 沉淀。 RNA 沉淀在 75%乙醇中可在 4 oC 保存一周或在 20 oC 保存一年。8. 敞开管口空气干燥 5-10 分钟使残留液体挥发，RNA 略微沉淀干燥即可。用50-100 l 自备的 DEPC 处理的高压消毒纯水或 TE 溶解沉淀。RNA 溶液可保存于70 oC 或液氮中。 注意：过分干燥将使 RNA 难以溶解。 55 oC 加热或反复冻融数次可以助溶。 RNA 溶液加 3 倍体积乙醇冻存于 20 oC，用时离心沉淀。说明1. 每 100 mg 组织 RNA 预期得率为：肝脾 60-100 g, 肾 50 g, 脑组织 10-15 g, 胎盘 20-40 g, 脂肪 5
15、0 g。1 x 10 7 个细胞通常得 50-100 g。1. 测定 OD 值，根据 OD260 计算 RNA 浓度。OD260/280 比值可初步判断RNA 质量，比值在 1.6-2.0 之间均属正常。起始组织量过大，或吸取了有机相或碎片，将使 RNA 样品中蛋白和杂质含量高，RNA 沉淀乙醇洗涤不充分( 步骤 7)，均可导致 OD260/280 比值降低。但切记 OD260/280 比值还受很多非质量因素的影响。例如，RNA 用水溶解或 pH 偏酸 OD260/280 偏低，用 TE 或离子强度较高的溶液溶解时较高，但均不影响 RNA 后续使用。切记即便是已降解的 RNA，OD260/28
16、0 比值也能达到看似完美的 2.0 左右，因此该比值并非判断 RNA 降解与否最佳的指标。判断 RNA 质量的最佳途径是进行普通 RNA 琼脂糖电泳检查 RNA 完整性。 2. 检查 RNA 完整性。取 1 g RNA 样品进行 1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外灯观察。28S RNA5 kb 亮度应该约为 18S RNA2 kb 的两倍，有时可见 0.1-0.3 kb 的 5S RNA。3. 调整 RNA 溶液的体积或重沉淀 RNA。 （1）加入适量 DEPC 处理过的高压消毒纯水或 TE 缓冲液，于 RNA 溶液中，使溶液体积补齐到约 400 l；（2）加入 0.1 体积的 3M 醋酸钠 pH 5.2，混匀；（3）加入 2.5 体积的纯乙醇，混匀；（4）冰上孵育 10 分钟；（5） 12,000g 4 oC 离心 10 分钟，弃上清；（6） 执行上述 RNA 提取程序的步骤 68。4. RNAtrip 勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤，立即用大量水清洗。
