1、思考题第二章 分子克隆工具酶1 简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例） 。3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。引起星星活性的因素:甘油浓度高（5%） ，酶过量 （100U/ml） ，离子强度低（8.0） ，或是加了有机溶剂如 DMSO（二甲基亚砜） 、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基 甲酰胺，或是用其它 2 价阳离子如 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+代替了 Mg2+。4
2、.T4 DNA ligase 和 E.coli ligase 有什么异同？5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是 37 ，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在 4-16间，通常多选用 12-16 30 分钟到 16 小时。6.什么是 Klenow 酶？有什么作用？Klenow DNA 聚合酶是从全酶中除去 53外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 35 外切活性不受影响。也称为 Klenow 片段（Klenow frgment） ，或 E.coli DNA聚合酶 大片段（E.coli DNA polymeraselarge f
3、ragment） 。 它也可以通过基因工程得到，分子量为 76 kDa。 由于没有 53 外切活性，使用范围进一步扩大。 补平 3凹端，如果使用带标记的 dNTP，则可对 DNA 进行末端标记。 抹平 DNA3凸端 在 35外切活性 通过置换反应对 DNA 进行末端标记 在 cDNA 克隆中合成第二链 随机引物标记 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？8.哪些工具酶可以用于探针标记？T4 DNA 聚合酶的替代合成法标记 DNA 探针。反转录酶还可利用单链 DNA 或 RNA 作模板合成分子探针。第三章 分子克隆载体1.基因工程载体应具备哪
4、些特点？能在宿主细胞中独立复制； 有一定的选择标记，易于识别和筛选； 有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源 DNA，而不影响其本身的复制; 最好有较高的拷贝数，便于载体制备。2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？能独立复制的单链或双链 DNA;选择标记基因；合适的限制酶位点。3.请简要描述 噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。 4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？丝状噬菌体载体的优点a.可产生单链 DNA 或双链 DNA，分别用于不同的目的单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针双链：为含双链 RF DNA 存在于细菌菌落中，可供基
5、因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链 DNA。具有质粒的优点b.丝状噬菌体所能包装的 DNA 长度没有一定的限制， 有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体 DNA 长 7 倍的 DNA。缺点a.较大的外源 DNA 片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。 b.单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子( 尤其是双链分子)比较费力，同时由于重组 DNA 容易产生缺失，培养时间不能长，故所得 DNA 的量有限。 c.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源 D
6、NA片段的情况，这是因为外源 DNA 反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。克服“缺失”的办法a.侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养 b.应用贮存于-70，重组 phage M13 感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养 c.培养时间应尽可能短(通常 4-8h) d.收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养 (因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子)。第四章 人工染色体载体1.大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？2.简述利用 YAC 克隆载体构建基因文库的原理。3.简述黏粒、YAC、BAC 克隆载体、P1 噬菌
7、体载体的基本构成元件。4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？ 黏粒的优点（1 ）同时具有 噬菌体和质粒载体的特性（2 ）具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点a.两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生 重组，结果使克隆的外源 DNA 片段重排或丢失。 b.含不同重组 DNA 的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源 DNA 片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。 c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。第五章 表达载体1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多
8、了哪些功能元件，各有什么生物学功能？ 2.简述利用 T7 噬菌体启动子的 pET 系列表达载体的工作原理。 3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？ 4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？ 5.分泌表达载体需要哪些基本元件？ 6.什么是融合表达？有什么优点？ 第 8 章 PCR 技术及其应用1.简述 PCR 扩增的原理和过程？PCR 反应特点：特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低PCR 的基本原理是什么？用 PCR 扩增时，必须预先得知什么信息？a.DNA 的半保留复制原理，在体外进行 DNA 的变性、复性和引物延伸。b.至少要知道足够合成一对引物的靶 DNA 序列。过程:
9、a.变性（denaturation ）：将模板 DNA 置于 92-96，使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA，且热 变性不改变其化学性质； b.退火（annealing）：将温度降至 37-72， 使引物与模板的互补区相结合； c.延伸（extension ）：在 72 条件下，DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3-OH 端，合成 DNA。 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。PCR 引物有哪些基本要求？在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1 M，即 1pmol/l，在 100 l 反应体系中相
10、当 于 6x1013 个分子。如果 5%用于扩增 1 kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 g 的产物，足以用于常规分析。 引物设计要考虑的几个问题 长度：至少 16 bp，通常为 18-30 bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 解链温度（Tm 值）：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5。 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3 个碱 基） GC 含量尽量控制在 40%-60%之间，4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3末端的重复排列。 引物的 3末端最好是 G 或 C，但不要 GC 连排。PCR 技术产生污染的主要原因
11、和预防方法？污染原因：1、样本间交叉污染 2、PCR 试剂污染 3、PCR 扩增产物污染 4、实验室中克隆质粒的污染 预防方法：A.防止污染：试剂小量分装，吸头及 EP 管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作B、设立对照：阳性对照 阴性对照 包括：标本对照和试剂对照。PCR 技术有哪些应用？2.T/A 克隆的基本原理是什么？ 第九章 DNA 序列分析1.简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。a.原理：将待测 DNA 片段的 5端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的 DNA 片段，这些
12、以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-by-lane ）的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的 DNA 的碱基序列。 b.核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5 或 3）打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。化学降解测序法的基本步骤包括：（1 ）对待测 DNA 片段的 5端磷酸基团作放射性标记； （2 ）用化学修饰剂修饰特定碱基； （3 ）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度（4 ）读序，由于在同一反应体系中，各 DNA 片段的标记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至标记 端起始部位之间的距离（片段长度） ，即可得出
13、碱基顺序。化学降解测序法的应用Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差； a.对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序。 b.化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基 腺嘌呤、GC 含量较高的 DNA 片段以及短链的寡核苷酸片段的序列。 c.测定长度大约 250 个碱基2.简述 Sanger 双脱氧链终止法测序的原理。 双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3位置的- OH 缺失，致使下位核苷酸的 5磷酸基团无法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正 在合成的 DNA 链中，该股 DNA 的合成就到此终止。3.试述化学降解法和双脱氧链终止法的
14、异同点。第十一章 DNA 文库的构建和目的基因的筛选1.基因组 DNA 文库有哪些类型？其相关的特点是什么？ 质粒文库质粒是最早用于构建基因组文库的载体，质粒载体所容纳的外源 DNA 片段一般在 10 kb 以内。 这类基因组 DNA 文库一般应用于“鸟枪法” 全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。 噬菌体文库噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有 l 噬菌体载体、M13 单链噬菌体载体、P1 噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。 M13 载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建 cDNA 文库或 BAC 和 PAC 亚克隆文库。 噬菌体文库中应用最广泛
15、的是 l 噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用 l噬菌体构建的基因组 DNA 文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用。 黏粒文库黏粒又称柯斯质粒，是由 l 噬菌体的 cos 序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。 黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组 DNA 文库。 利用它们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组 DNA 文库等。 人工染色体文库包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和 P1 人工染色体文库，也称为大片段基因组 DNA 文库，容纳的外源 DNA 片段为 100 kb-1 Mb。 主要用于大
16、基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越 来越广泛。 亚基因组文库亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某 一区段，如基因组 DNA 某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段（如一个 YAC 或 BAC 克隆等） 。2.构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？3.均一化 cDNA 文库构建的基本原理是什么？mRNA-cDNA 杂交方法的原理是用过量的驱动 mRNA 与供体的 cDNA 文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化的、扣除杂交 cDNA 文库。4.扣除 cDNA 的基本原理是什么
17、？扣除杂交技术（subtractive hybridization） 将含目的基因的组织或器官的 mRNA 群体作为待测样本（ tester） ，将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的 mRNA 群体作为对照样本（ driver） 。将 tester 和 driver的 cDNA 进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。5.全长 cDNA 文库构建的原理？6.酵母双杂交的基本原理？酵母双杂交系统简称双杂交系统（two-hybrid system） ，也叫相互作用陷阱（inte
18、raction trap） ，是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是探针的直接编码物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与已知基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因。 酵母双杂交系统的基本原理来自酵母转录激活因子（transcriptional activator）GAL4 是一种典型的转录因子，有两个功能域: 一是 DNA 结合结构域（DNA binding domain, BD） 靠近羧基端,含有几个锌指结构，可与 DNA 序列中半 乳糖苷酶的上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）结合； 二是转录激
19、活结构域（activation domain, AD）, 可与 RNA 聚合酶或转录因子 TFII 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。这两个结构域的功能是独立的。 酵母双杂交系统利用融合蛋白的策略，将要筛选的“探针”蛋白 X 与 BD 融合为 BD-X（通常称为诱饵， bait） ； 将所要筛选的对象 Y 与 AD 构建成融合蛋白的 AD-Y cDNA 文库（即将目的 cDNA 与 AD 基因构建融合基因 文库） ，通常称 AD-Y 为猎物（prey） ； 将它们导入酵母细胞中共表达，如果 X 与 Y 相互作用，则会导致 BD 和 AD 在空间上接近形成一个有功 能的转录激活因子，激活下游
20、报告基因的表达。 第十三章 植物基因工程1.植物基因转化受体系统具备的条件？ a.高效稳定的再生能力 b.较高的遗传稳定性 c.具有稳定的外植体来源 d.对选择抗生素敏感 e.对农杆菌有敏感性 f.是否具有经济价值或有潜在的生产应用价值2.植物基因工程常用的受体系统有哪些？a.愈伤组织再生系统 b.直接分化再生系统 c.原生质体再生系统 d.生殖细胞受体系统3.植物基因转化方法有哪些？a.原生质体介导法 包括： PEG 介导的基因转化脂质体介导基因转化电激法介导基因转化显微注射介导的基因转化激光微束介导的基因转化b.基因枪法 c.根癌农杆菌介导法4.农杆菌转化的基本原理？ 5.什么是二元载体？
21、和一元载体比有什么优点？二元载体(binary vector)系统是指由两个分别含 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变质粒构成的双 质粒系统因为其 T-DNA 与 Vir 基因在两个独立的质粒上，通过反式激活 T-DNA 转移，故称之为反式载体(trans vector)。二元载体较一元载体有更多的优点：a.首先，二元载体的构建较为方便；而一元载体还需在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低。 b.其次，二元载体的外源基因的转化效率要高于一元载体。 所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元载体系统。6.植物转化常用的选择基因和报告基因有哪些？报告基因有什么特点？ 植物基因工程中的选择标记
22、基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。选择基因:与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞； 最常用的有新霉素抗性基因（neor） 、庆大霉素抗性基因（gentr） 、潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因（hpt） ，以及膦丝菌素乙酰转移 酶基因（bar）等。报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞（ 器官或组织） ，是否启动表达的一类特殊用途的基因。 提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。 理想的报告基因具备的基本要求 报告分子不存在于宿主中或易于与内源性基因相区别； 应有一个简单
23、、快捷、灵敏及经济的分析方法； 报告基因的分析结果应具有很强的线性范围，便于分析启动子活性的大小变化； 报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物体生理活动。 最常用的报告基因-葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）荧光素酶基因（luc绿色荧光蛋白（GFP）基因（gfp）等。7.转基因植株的鉴定方法有哪些，作为一组完整的转基因植株鉴定数据至少应包含哪些参数？a.PCR 检测外源基因的整合 b.Southern 杂交检测外源基因的整合 c.RT-PCR 检测外源基因的表达 d.Northern 杂交检测外源基因的表达 e.Western 杂交检测外源基因表达的产物第十四章 动物基因
24、工程1.简述反转录病毒在动物基因工程中的作用。2.试述基因敲除与基因敲入的区别。 3.质粒载体与病毒载体有何异同？ 表达载体:(1)带有原核复制区(2)带有选择性标记基因保证重组 DNA 分子能够在大肠杆菌中扩增(3)必须包括能在真核细胞表达的相关组件一般包括转录外源 DNA 序列的启动子元件、转录产物有效地加上 poly(A)尾巴所必需的信号序列、 真核细胞中的选择性标记，以及一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受体点，以保证外源基因的高效表达。病毒载体： 携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 介导外源基因的转移与表达； 对机体不致病。4.简述转基因小鼠的制备过程。DNA 显微注射法制备转
25、基因小鼠胚胎干细胞法制备转基因小鼠DNA 显微注射法制备转基因小鼠 超数排卵对年轻、健康未孕母鼠（4-5 周龄）注射促性腺激素，诱导超数排卵，与种公鼠合笼交配。从输卵管的壶腹部收集原核期受精卵，排卵率一般可达 30 枚以上，但具体排卵多少受激素种类和小鼠品种影响较大。 基因准备从整合率上看线形 DNA 分子要好于环形 DNA，而环形 DNA 在细胞内的半衰期较长，适用于瞬间表达与基因治疗。 尽管载体 DNA 序列不影响外源 DNA 的整合效率，但载体序列能抑制转基因的表达，因此应尽量去除转基因结构中的载体部分。 显微注射(1)外源 DNA 进入原核(2)培养液中培养(3)进行冷冻保存，或直接用
26、于移植，或继续培养发育到囊胚后再移植。 胚胎移植胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依据早期胚胎的发育阶段和物种的不同决定移植的部位。 注射后的单细胞至桑葚期的胚胎应移植到 0.5d 假孕鼠的输卵管内，而达到囊胚期的胚胎则须转移至 2.5 d 假孕鼠子宫内。 未经注射的新鲜胚胎的移植成功率为 50%-70%， 注射胚胎移植后的受胎率有所下降，仅为10%-30%。 转基因个体鉴定接受胚胎移植的假孕鼠产下的幼鼠是否含有外源基因？ （1 ）分子鉴定，判定其基因组内是否整合了外源基因（2 ）目的蛋白表达与否和表达水平测定（3 ）产物的分离纯化及生物活性检测2胚胎干细胞法制备转基因小鼠胚胎干细胞（embr
27、yonic stem cells， ESCs）: 从早期胚胎内细胞团（inner cell mass, ICM）中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。 当将胚胎干细胞人工注入宿主早期胚胎的囊胚腔内（又称内细胞团注射）后，所注入的胚胎 干细胞可以同宿主内细胞团细胞共同发育，分化成成体动物的各种组织（包括生殖细胞）， 形成嵌合体。 a.转基因胚胎干细胞的获得b.囊胚注射c.嵌合体的检测和育种5.转基因动物的鉴定方法有哪些？a.标记筛选法 利用正负筛选标记b.分子鉴定法：PCR 扩增、斑点杂交、 Southern 杂交、荧光原位杂交c.表达水平检测：报告基因检测、 Norther
28、n 杂交、 RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Western 杂交、目的蛋白的生物活性检测判定是否产生出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中，即是否能够稳定遗传。第十五章 酵母基因工程2.作为一个酵母表达载体，包括那些基本元件？ 典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒。原核部分：大肠杆菌中 ori 和抗生素抗性序列。 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的 2m 质粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列（auto-replication sequence, ARS） ，或整合型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 分
29、泌型表达载体还要带有信号肽序列酵母表达载体主要元件启动子最常用的启动子是基因 AOX1 的启动子，在它控制 下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达。 PGAP（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）：在毕赤酵 母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的 -LacZ 基因表达率比甲醇诱导下的以 PAOX1 启动 的产量更高。 PGAP 不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因 其产量很高，所以成为代替 PAOX1 的最具潜力的启动子。 选择标记常用 HIS4，以及 ARG4、TRP1 或 URA3 作选择标记的载体。 巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因 SUC2 作为选择标记。 抗
30、性选择标记有抗生素 G418 抗性基因和 Zeocin 抗性基因（一种强诱变剂） 。 leu-作为酵母载体的选择标记基因 信号肽序列表达外源蛋白分胞内表达和分泌表达。 毕赤酵母本身基本不分泌内源蛋白，所以外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。 如果自身信号肽序列效果不佳，可用 -交配因子引导序列引导外源蛋白的分泌。在巴斯德毕赤酵母载体中还使用过蔗糖酶基因 SUC2 的信号肽序列、酸性磷酸酶基因 PHO1 的信 号肽序列等。3.叙述附加型表达载体和整合型表达载体用在表达外源基因上的区别。4.如何提高基因在染色体上的拷贝数来提高异源基因的表达量？附什么是蓝白斑筛选法？ 答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌 -半乳糖苷酶（lac）的基因片段，携带有 lac 基因片段的载体转入 lac-宿主菌后，在含有 X-gal 平板上形成浅蓝色的菌落或噬菌斑。外源基因插入 lac（或 lac 基因部分被取代）后，重组的菌体或噬菌斑将丧失分解的能力，转入 lac-宿主菌，在含有 X-gal 平板上形成白色的菌落或噬菌斑，非重组的菌落或噬菌斑则为蓝色。
