1、扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变【关键词】 扩展青霉脂肪酶; 定点突变; 随机突变; 易错 PCR; 【英文关键词】 Penicillum expaasum lipase; Site-directed mutagenesis; Random mutagenesis; error-prone PCR; 【中文摘要】 本研究利用定点突变和随机突变的方法,对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)进行了蛋白质工程改造。 1.PEL 的定点突变 采用重叠延伸 PCR 的方法,对扩展青霉脂肪酶进行多个点突变,选取了十一个突变位点,构建了 7 个单点突变体和 8
2、个叠加突变体(与随机突变体 ep8 叠加) 。将获得的突变基因在毕赤酵母中表达,并进行酶学性质的研究。 (1)P197E 的单点突变及叠加突变：PEL-P197E 酶活为 556U/mL,Tm 值比野生型提高了 0.90C。PEL-ep8-P197E 酶活为 592U/mL,其 Tm 值比野生型脂肪酶 PEL 的提高 2.80C,比随机突变体 PEL-ep8 提高 2.2；此外,叠加突变体 PEL-ep8-P197E的底物特异性发生了改变。 (2)K152R 的单点突变及叠加突变：PEL-K152R 酶活为 530U/mL,PEL-ep8-K152R 酶活为 416U/mL,二者的热稳定性与与
3、野生型无明显差别。 (3)P102L 的单点突变及叠加突变：PEL-P102L 酶活为 300U/mL。PEL-ep8-P102L 的酶活为612U/mL,最适作用温度提高了 50. 【英文摘要】 In order to improve the enzyme properties of the Penicillum expaasum lipase(PEL), the PEL gene was mutated by site-mutagenesis and random mutagenesis. 1. Site-directed mutagenesis of PEL In order to im
4、prove the thermostability of Penicillium expansum lipase (PEL), Eleven mutations were created by site-directed mutagenesis. Mutations were generated by overlap extension PCR using the cDNA of wild-type lipase gene(lip07) or a single site mutant lipase ep8 as the template and two special primers that
5、 corresp.摘要 2-4 Abstract 4-6 中文文摘 7-13 第一章 绪论 13-35 1 理性设计 14-15 2 非理性设计 15-34 2.2 突变体库的构建策略 16-29 2.2.1 基于 PCR 而实现的随机突变 16-19 2.2.2 基于同源重组而实现的随机突变 19-27 2.2.3 基于非同源重组而实现的随机突变 27-29 2.3 定向进化筛选策略 29-34 2.3.1 表型观察选择和筛选 29-30 2.3.2 微孔板滴定法 30-31 2.3.3 各种展示技术 31-34 3 半理性设计 34-35 第二章 材料与方法 35-51 1 实验材料 35
6、-38 1.1 菌种和质粒 35 1.2 酶与试剂 35 1.3 常用培养基及缓冲液 35-37 1.4 寡核苷酸引物 37-38 1.5 常用仪器 38 2 实验方法 38-51 2.1 扩展青霉脂肪酶的定点突变 38-47 2.1.1 P197E、K152R、P102L、N166D 的单点突变及叠加突变 38-44 2.1.2 P163A、M193V 、K120R 的叠加突变 44-46 2.1.3 G205A、K94R、W169N、K94D 的单点突变 46-47 2.2 扩展青霉脂肪酶的随机突变 47-51 2.2.1 突变体库的获得 47-48 2.2.2 随机突变基因表达载体的构建
7、及表达 48 2.2.3 酶学性质的测定 48-49 2.2.4 突变体脂肪酶基因的序列测定 49-51 第三章 结果与分析 51-83 1. PEL 的定点突变 51-78 1.1 突变点的选择 51-52 1.2 P197E 的单点突变及叠加突变 52-58 1.3 K152R 的单点突变及叠加突变 58-64 1.4 P102L 的单点突变及叠加突变 64-67 1.5 N166D 的单点突变及叠加突变 67-71 1.6 P163A 的叠加突变 71-73 1.7 K120R、M193V 的叠加突变 73-76 1.8 G205A、 K94R、K94D 、W169N 的单点突变 76-78 2 PEL 的随机突变 78-83 2.1 随机突变基因的获得 78-79 2.2 表达质粒库的构建及在毕赤酵母中的表达 79-80 2.3 突变体的酶学性质 80-82 2.4 突变体核苷酸序列测定 82-83 第四章 小结与讨论 83-89 1 PEL 的定点突变 83-86 2 PEL 的随机突变 86-89 结论 89-93 1 定点突变 89-90 2 随机突变 90-93 参考文献
