1、PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤,即:模板 DNA 的变性、模板 DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR 反应体系包括 5 种基本成分,依次为:引物、DNA 聚合酶、dNTP、模板 DNA、Mg2+。PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤,即:模板 DNA 的变性、模板 DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR 反应体系包括 5 种基本成分,依次为:引物、DNA 聚合酶、dNTP、模板 DNA、Mg2+。1、引物引物是 PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上,只要知道
2、任何一段模板 DNA 序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:引物长度: 15-30bp,常用为 20bp 左右。引物扩增跨度: 以 200-500bp 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。引物碱基:G+C 含量以 40-60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布,避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基
3、,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量: 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。2、酶目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时),浓度过
4、高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。3、dNTPdNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5,小量分装, -20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中,dNTP 应为 50200umol/L,尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 M
5、g2+结合,使游离的 Mg2+浓度降低。dNTP 储存液:dNTP 溶于 pH 为 7.0 的 NaOH 贮存液中,最初的贮存液可稀释到10mol/L,分装后存放在-20冰箱中。dNTP 使用浓度在 20200 mol/L 之间。4 种 dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。dNTP 使用浓度:在 PCR 反应中,使用低 dNTP 浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低 dNTP 浓度。例如在 100l的反应体系中,4 种 dNTP 的浓度为 20mol/L,可基本满足合成2.6g DNA 或10pmol/L的 400bp 序列。使用低 dNT
6、P 浓度(每种 dNTP 浓度为2mol/L),能够高度灵敏地(1/107)扩增 ras 基因点突变的等位基因。4、模板模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败与否的关键环节之一,传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白质,特别是与 DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶
7、解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K法,要防止 RNase 降解 RNA。5、Mg2+浓度Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的 PCR 反应中,各种dNTP 浓度为 200umol/L 时,Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。引物是 PCR 特异性反应的关键,不好的引物严重影响实验的质量,好的引物可以事倍功半;酶的选择一般是看实验的目的,例如克隆长片段,可能就需要高保真的聚合酶;dNTP 浓度和 Mg2+浓度高了会影响 PCR 反应特异性。DNA 模板中还有蛋白质也会严总影响 PCR 质量,因此上述 5 个基本成分质量和浓度必须合理。