1、重酒石酸去甲肾上腺素的杂质检验研究方法C8H11NO3.C4H6O6本品为 (R)-4-(2- 氨基 -1- 羟基乙基 )-1， 2-苯二酚重酒石酸盐一水合物。按无水物计算，含 C8H11NO3.C4H6O6不得少于 99.0%。【1. 性状】1.1 重酒石酸去甲肾上腺素为白色或类白色结晶性粉末，无臭，味苦。遇光或遇空气易变质。 （本品分子结构中具有邻苯二酚结构，露置空气中或遇光、热易氧化，色泽变深，故因注意贮藏条件。 ）1.2 溶解度 易溶于水，微溶于乙醇，难溶于乙醚、氯仿。(去甲肾上腺素含有酚羟基,氨基等亲水基团,极性偏大;其在酸性条件下较稳定,故一般与重酒石酸形成的形式;)1.3 熔点
2、熔点为 100106 ，熔融时同时分解，并显浑浊。 （可以用熔点,熔程鉴别化合物,但本品熔融时同时分解，故用热分析法分析鉴别较适宜）1.4 比旋度 取本品精密称定，加水溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含 50mg 的溶液，比旋度为-10.0至-12.0(左旋去肾上腺素的活性是右旋去甲肾上腺素的 27 倍,药用常用左旋体,根据比选度的测量也可作为其鉴别的方法之一)【2. 鉴别】重酒石酸去甲肾上腺素属于儿茶酚胺类药物，根据其根结构和性质，可采取如下方法进行鉴别试验。2.1 与三氯化铁反应2.1.1 原理重酒石酸去甲肾上腺素分子结构中具有邻苯二酚，其酚羟基极易被 Fe3+氧化而现色;碱性条件氧化加
3、剧，加入碳酸氢钠试液后产物颜色加深。2.1.2 方法取本品约 10mg，加水 1ml 溶解后，加三氯化铁试液 1 滴，振摇，即显翠绿色：再缓缓加碳酸氢钠试液，即显蓝色，最后变成红色。2.1.3 方法学考察专属性：应不受可能共存的物质干扰，其他结构相似的物质均应呈负反应(本法专属性差)耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大2.2 氧化反应2.2.1 原理本品结构中具有酚羟基，易被碘氧化而呈色。加硫代硫酸钠过剩的碘被还原。2.2.2 方法取本品约 1mg，加酒石酸氢钾的饱和溶液 10ml 溶解后，加碘试液 1ml，放置 5 分钟后，加硫代硫酸钠试液 2ml，溶液为
4、无色或仅显微红色或淡紫色。2.2.3 方法学考察专属性：应不受可能共存的物质干扰，其他结构相似的物质均应呈负反应。(本法专属性差)耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大2.3 紫外分光光度法（UV）2.3.1 原理比较重酒石酸去甲肾上腺素在最大吸收波长与最小吸收波长处吸光度的比值。2.3.2 方法对照品比色法：分别制备标准对照品和样品溶液，进行紫外分光光度测定，对比对照品和样品分别在最大与最小吸收波长处吸光度的比值。2.3.3 方法学考察专属性：考察其他可能共存的物质在去甲肾上腺素最大与最小吸收波长处的吸收行为，不应有干扰。(本法专属性较好)耐用性：将样品试液
5、放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大2.4 红外分光光度法(IR)2.4.1 原理化合物分子通过分子转动和振动能级的跃迁吸收红外光而形成红外吸收光谱，通过比较标准对照品德红外谱图来进行鉴别分析。2.4.2 方法与标准对照品图谱进行对比，观察其吸收峰，应一致。2.4.3 方法学考察专属性：其他可能共存的物质的红外吸收图谱应不对其造成干扰。(本法专属性好)耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大2.5 HPLC 法2.5.1 原理HPLC 法以一定的流动相将样品输入色谱柱，根据各组分的不同极性而实现分离，再进入检测器进行检测。2.5.2 方法与对照
6、品图谱进行对比，供试品峰的保留时间应与对照品峰一致。(本法专属性较好)2.5.3 方法学考察专属性：考察其他可能共存的物质与主成分的分离度，应大于 1.5。耐用性：不同厂牌、不同批号同类型的色谱柱，柱温，流动相组分、pH 值,流速等因素发生微小变动后，考察理论塔板数，分离度，拖尾因子等能否通过系统适用性实验,保留时间是否一致。2.6 TLC 法2.6.1 原理利用对照品及样品溶液在薄层板上的展开行为对比，根据其比移值和分离效能进行鉴别。2.6.2 方法选用同浓度的对照品与供试品溶液在同一波层上点板，观察斑点的大小、位置、颜色是否一致2.6.3 方法学考察专属性：其他可能共存的物质应与主斑点能良
7、好分离。 （本法专属性较好）耐用性：不同批号同类型的薄层板，流动相组分、温度等因素发生微小变动后，考察分离度等能否通过系统适用性实验，比移值是否一致。2.7 鉴别方法的最终确定在众多的鉴别方法中，本文仅简单阐述了以上几种。与三氯化铁显色反应以及氧化反应操作简便，耗时短，但存在专属性差的缺点；UV 法和 TLC 法操作简便，准确度较高，专属性较显色反应和氧化反应好；IR 法和 HPLC 法具有特征性强，专属性好的优点。在综合考虑各种方法之后，最终选用与三氯化铁试液的显色反应，IR 和HPLC 法进行重酒石酸去甲肾上腺素的鉴别试验，通过这三种原理不同的方法，可以对重酒石酸去甲肾上腺素的鉴别试验达到
8、良好的效果。【3. 检查】3.1 溶液的澄清度与颜色依据：去甲肾上腺素极易氧化变质，可能产生沉淀，颜色改变，故应对其进行澄清度与颜色检查方法：目测其液体制剂应澄清无色，其原料药用适宜的溶剂溶解后，应澄清无色。专属性：由于目测，本法专属性低检测限：人视觉可以判断的限度耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大3.2 酮体依据：药物在生产中均由其酮体氢化还原制得，若氢化不完全，易引入酮体杂质。酮体在 310nm 处有最大吸收方法：取本品，加水制成每 1ml 中含 2.0mg 的溶液，照紫外-可见分光光度法，在 310nm 的波长处测定，吸光度不得超过 0.05。专属性
9、：其他可能共存的物质和去甲肾上腺素在 310nm 处没有吸收，本法专属性较好。检测限：不同仪器不同方法有不同检测限。耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大3.3 水分依据：利用碘将二氧化硫氧化为三氧化硫时，需要一定的水分参与反应，根据消耗碘的量来测定水分的含量。方法：取供试品适量，加入无水甲醇，不断搅拌下，用费休氏试液滴定至终点。另取无水甲醇同量，按同法进行空白试验。水分应为 5.0%-6.0%。专属性：原料药中去甲肾上腺素易与水结合，其他可能共存的物质不含结合水，本法测定水分含量专属性较高。耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化
10、不大3.4 炽灼残渣依据：有机药物经炭化后，高温炽灼，能产生非挥发性的无机杂质的硫酸盐。方法：取供试品适量，置已炽灼至恒重的坩锅中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸 0.51ml 使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700800炽灼至恒重，不得过 0.1%。专属性：本法检测样品中的金属含量专属性较好耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大3.5 有关物质取本品，加流动相 A 溶解并稀释制成每 1 ml 中约含 5 mg 的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相 A 定量稀释制成每 1 ml 中约含 15 ug 的溶液，作为对照溶液。高效液相色谱法
11、试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.05%庚烷磺酸钠的溶液（用磷酸调节 PH 值至 2.2）为流动相 A；乙腈-0.05%庚烷磺酸钠溶液（1:1） （用磷酸调节 pH 值至 2.4）为流动相 B，照下表进行梯度洗脱，检测波长为 280 nm；流速为每分钟 1.5 ml。 时间（分钟） 流动相 A（%） 流动相 B（%）0 98 21 98 220 70 3025 50 5025.1 98 235 98 2取本品 10 mg，加 0.1mol/L 盐酸溶液 5 ml 使溶解，取 1 ml，加 30%过氧化氢溶液 0.1 ml，摇匀，在紫外灯光（254 nm）下照射 90 分钟，加流动相
12、 A 9ml，摇匀，作为系统适用性试验溶液，取系统适用性试验溶液 20 ul，注入液相色谱仪，主成分峰的保留时间约为 11 分钟，主成分峰后应出现一个未知降解产物峰与去甲肾上腺酮峰，去甲肾上腺酮峰的相对保留时间约为 1.3，理论板数按去甲肾上腺素峰计算不低于 5000，主成分峰与相邻杂质峰之间的分离度应符合要求，取对照溶液各 20 ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有与去甲肾上腺酮峰保留时间一致的色谱峰，其峰面积乘以 0.3 后不得大于对照溶液主峰面积的 1/3（0.1%） ；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的 1/3（0.1%） ；杂质总量不得过 0.3%
13、。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积 1/6 倍的峰可忽略不计。专属性：其他可能共存的物质和去甲肾上腺素分离良好，本法专属性好。检测限：一般以信噪比（S/N）=3:1 时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大；不同厂牌、不同批号同类型的色谱柱，柱温，流动相组分、pH 值,流速等因素发生微小变动后，考察理论塔板数，分离度，拖尾因子等能否通过系统适用性实验,保留时间是否一致。4. 含量测定4.1 非水溶液滴定法4.1.1 原理重酒石酸去甲肾上腺素分子结构中含有显弱碱性的 N 原子，可采用非水溶液滴定法测定其含量。4.1.2
14、 方法取供试品适量，精密称定，用冰醋酸溶解，加结晶紫试液，以高氯酸滴定液滴定至显蓝绿色，同法进行空白试验校正。以消耗高氯酸滴定液的体积和相应滴定度计算供试品含量。实验条件控制：1.采用非水溶液滴定法进行含量测定时，如果测定药物碱性较弱，终点不够明显可加入醋酐，以提高其碱性，使终点突越明显。2.如果测定氢卤酸盐时，常常需要加入醋酸汞试液以消除氢卤酸的干扰。本品为重酒石酸盐，产生的重酒石酸不会对测定产生干扰。4.1.3 方法学考察专属性：应不受可能共存的物质干扰，并制备模拟样品，其他结构相似的物质均应呈负反应。精密度：精密称取重酒石酸去甲肾上腺素供试品适量，配制成溶液，分别取样6 次，进行滴定，考
15、察结果的 RSD 值。重现性：分别精密称取 6 份适量的重酒石酸去甲肾上腺素供试品，配制成 6 份溶液溶液，同法依次分别滴定，考察结果的 RSD 值。稳定性：配制已知浓度的重酒石酸去甲肾上腺素供试品溶液，在室温下放置，于 0，1，2，3，4，5，6 h 分别滴定，计算含量，考察其 RSD 值。耐用性：将样品试液放置一段时间后（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大。4.2 高效液相色谱法4.2.1 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.14%庚烷磺酸钠溶液-甲醇（65:35） ，用磷酸调节 pH 值至 3.00.1，作为流动相；检测波长为 280nm；流速：1ml/m
16、in；柱温：30；进样量：20l。理论板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰计算不低于 3000。4.2.2 方法精密量取本品适量（约相当于重酒石酸去甲肾上腺素 4mg） ，置 25ml 量瓶中，加醋酸溶液（125）稀释至刻度，摇匀，取 20l 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取重酒石酸去甲肾上腺素对照品适量，精密称定，加醋酸溶液（125）制成每 1ml 中含 0.16mg 的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。4.2.3 方法学考察专属性试验：取空白辅料溶液及重酒石酸去甲肾上腺素注射液的供试品溶液、对照品溶液各 20l，进样测定，空白辅料应不干扰重酒石酸去甲肾上腺素注射液的含量测定。线性关系及范
17、围：分别精密称取重酒石酸去甲肾上腺素适量，分别配成 6 种不同浓度的溶液，测定，记录色谱图。以重酒石酸去甲肾上腺素峰面积（X）对其质量浓度(Y，mg/ml)进行回归，得重酒石酸去甲肾上腺素的回归方程，从而得出线性关系与范围。检测限的考察：按信噪比 3:1 测得重酒石酸去甲肾上腺素的最小检测限。精密度试验：配制含量测定供试品溶液共 6 份，分别进样 20l，测定重酒石酸去甲肾上腺素注射液的标示量 RSD 值。准确度试验：按处方量的 80%、100%、120%分别配制三种不同浓度的重酒石酸去甲肾上腺素溶液，依法测定，计算重酒石酸去甲肾上腺素的平均回收率及RSD 值。耐用性：将样品试液放置一段时间后
18、（样品稳定性） ，用本法测量结果变化不大；不同厂牌、不同批号同类型的色谱柱，柱温，流动相组分、pH 值,流速等因素发生微小变动后，考察理论塔板数，分离度，拖尾因子等能否通过系统适用性实验,保留时间是否一致。4.3 紫外分光光度法4.3.1 原理基本原理在鉴别项中已述，利用其吸光度在一定浓度范围内与吸光度成正比，测定 280nm 处的吸光度，所得结果进行定量分析，再进一步确定其含量。4.3.2 方法选用对照品比色法。重酒石酸去甲肾上腺素对照品溶液的配制：精密称定重酒石酸去甲肾上腺素对照品适量，以去离子水配制成一定浓度的对照品溶液。供试品溶液的配制：精密称定重酒石酸去甲肾上腺素试品适量，以去离子水
19、配制成供试品溶液。含量测定：分别测定对照品和供试品在 280nm 处的吸光度，利用朗博比尔定律计算供试品的含量。4.3.3 方法学考察专属性：考察其他可能共存的物质在 280nm 处的吸收行为，不应有干扰。线性范围：精密称取重酒石酸去甲肾上腺素对照品适量，配制成一定浓度的对照品储备液；精密量取该贮备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置于 25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，制成一系列不同浓度的标准液，分别测定在280nm 处的吸光度，以吸光度对浓度进行线性回归，得回归方程。精密度：精密称取重酒石酸去甲肾上腺素供试品适量，配制成溶液，在 280nm处连续测定 6 次，考察结果的
20、RSD 值。重现性：精密称取重酒石酸去甲肾上腺素供试品适量，配制成 6 份溶液溶液，在 280nm 处分别测定其吸光度，考察结果的 RSD 值。准确度（回收率试验）：配制已知浓度的重酒石酸去甲肾上腺素供试品溶液，分别加入高、中、低 3 种浓度的重酒石酸去甲肾上腺素对照品溶液，每种浓度各 3 份，置于 10ml 容量瓶中，加水稀释至刻度。分别取适量进行测定，连续测定 3 次，取平均值计算回收率。稳定性试验：配制已知浓度的重酒石酸去甲肾上腺素供试品溶液，在室温下放置，于 0，1，2，3，4，5，6 h 分别测定在 280nm 波长处的吸收度，计算含量，考察其 RSD 值。 4.4 含量测定方法的最终确定根据药物的特点以及各种含量测定方法的特点，非水溶液滴定法对原料药的测定已有好的准确度和精密度，故决定最终选用非水溶液滴定法测定药物含量。
