1、试验五 小鼠肝匀浆 T-SOD 测定一目的掌握动物脏器 T-SOD 测定的方法；熟悉掌握 T-SOD 的概念及意义二方法及原理羟胺法：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2） ，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的 SOD 活力。三主要试剂及仪器T-SOD 试剂盒；550nm 的分光光度计；37恒温水浴或气浴箱；台式离心机；微量移液器；双蒸水；冰醋酸（分析纯，乙酸浓
2、度99.5%） ；旋涡混匀器;试剂配制：（1）试剂一：贮备液, 10ml1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用） ； 试剂一应用液的配制：用时每瓶 10ml 贮备液加双蒸水稀释至 100ml，4保存 1 年。 （2）试剂二：液体 10ml1 瓶，410保存 1 年。 （3）试剂三：液体 10ml1 瓶，410保存 1 年。 （4）试剂四：贮备液：350l2 支，4保存，不可冷冻； 4 号稀释液：10ml1 瓶，4保存 6 个月。 试剂四应用液的配制:用时按贮备液:稀释液=114 比例配制，用多少配多少。4保存，不可冷冻。 注：所用吸嘴为一次性吸嘴。（5）试剂五：粉剂1 支，
3、用时加 7080热双蒸水 75ml 溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用双蒸水补充至 75ml，配好后的试剂避光 4冷藏 1 年。（6）试剂六：粉剂1 支，用时加双蒸水 75ml 溶解后备用，配好后试剂避光 4冷藏保存 6 个月。 （7）显色剂的配制：按试剂五:试剂六:冰乙酸=3:3:2 的体积比配显色剂，用多少配多少，配好的显色剂 4避光冷藏 3 个月。注：1.冰醋酸（分析纯，乙酸浓度99.5%） 2.试剂五、试剂六必须分开进行配制(切不可将试剂五、试剂六混合后再进行配制), 否则不显色四操作步骤操作表：试剂 测定管 对照管试剂一应用液（ml） 1.0 1.0样品（ml） A*双
4、蒸馏水（ml） A*试剂二（ml） 0.1 0.1试剂三（ml） 0.1 0.1试剂四应用液（ml） 0.1 0.1用漩涡混匀器充分混匀，置 37恒温水浴 40 分钟显色剂（ml） 2 2混匀，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯，双蒸水调零，比色。最佳取样量 A 的确定方法：（1）最佳取样量的确定：分别以我们举例的取样量为中间值再加 10l 及减少 10l 做三只样本管及一只对照管按操作表进行预试验，以确定最佳取样量。（2）最佳取样量的计算：（对照管吸光度-测定管吸光度）对照管吸光度（3）最佳取样范围：应该在 0.150.55 之间，即百分抑制率在 1555%之间
5、（4）此段曲线基本呈正比曲线关系） 。（5）最佳取样量的选择：取百分抑制率在 45%50%左右的这一管的取样量作为最佳取样量。（6）最佳取样量的调整：若百分抑制率大于 60%时（曲线为平坦部分） ，则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试。若百分抑制率小于 20%时，则需将样品量加大后测试。最佳取样量参考值：1%组织匀浆 3050ul；五计算:定义：每毫克组织蛋白在 1ml 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位（U） )/(%50)/( mlgprotmlODmgprotSOD 待 测 样 本 蛋 白 浓 度）取 样 量 （反 应 液 总 体 积值对 照 值测 定值对 照活 力总 *mgprot 为毫克蛋白数。六注意事项1. A*代表样本取样量和双蒸水取样量。2. 最佳取样量因样品种类不同，其 SOD 活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系 (附录：SOD 标准曲线) ，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量。
