1、琼脂糖凝胶电泳,与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。 在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负极移动； 在pH8.08.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。,琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支 持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别 是DNA的方法。,琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一 种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要 用于分离较大片段的DNA分子（100bp60kb）。,一、电泳基本原理, 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为
2、电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到分离的目的。, DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范 围内是分子质量的函数，分子质量越大，移 动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对 于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相 对分子质量。,琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围,胶浓度（） 线性DNA分子大小（kb）,0.3 560 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.13,二、仪器设备及材料,1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压
3、可变范围0300600V，电流可变范围0250500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。,三、主要试剂,2、电泳缓冲液：常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。,4、10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力 搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室 温保存。,溴化乙锭（EB）染色原理：溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以 嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激 发下，发出橙色荧光。这是因为： 在紫外线
4、照射时，核酸吸收波长为254nm 的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； 同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收 302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面 的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可 见荧光。,溴化乙锭用于核酸染色的优点： 染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5g/ml 的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。 也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。,EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这一点。 EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。,溴化乙锭缺点：EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：操作中务必带上防护用手套。 如不慎皮肤与溶液接触
5、，应立即用清水彻底冲洗。 含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。,四、电泳操作步骤,2、胶床准备： 取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭 的两端贴上胶布或胶带纸，形成约58mm的挡墙。 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端 和床面有1mm的间隙。 将胶床放在调整好的水平台上。,1、凝胶准备：用0.5TBE配制2琼脂糖凝胶。 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5TBE； 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； 熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入EB0.5g/ml，并轻轻混匀。,3、铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶 床内，凝
6、胶厚度35mm。,4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床 两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中， 并使样品孔位于电场负极。,5、向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，以越 过凝胶表面12mm为宜。,6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现 有气泡，应设法去除。,7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积 1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。,8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般1030l。,9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压15v/cm；时间1小时左
7、右。,10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。,11、电泳结果分析： 紫外检测仪直接观察电源条带； 摄影记录； 凝胶成像分析系统处理。,五、注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免 突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要 碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB 的溶液应做净化处理。,
