1、抗菌肽 抗菌肽概述 抗菌肽 (Antibacterial Peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides),是由多种生物细胞特 定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细 菌、真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞 等活性作用的多肽。由于抗生素的广泛使用导致了微生物耐药 性,新型抗菌药物研发成为 近年研究热点,而抗菌肽是生物天然免疫重要的效应分子,具有调节宿主 免疫的作用,所以有 极大的临床应用潜力。目前已 有 2200 多种的抗菌肽,来源有细菌、真菌、人体、昆 虫等, 其中有些抗菌肽的基因序列已得到测定。抗 菌肽具有多种优点,如无毒副作用(仅少数种类 具 有溶血活性
2、)、无污染、无残留,难以产生耐药性, 能 抑制癌细胞扩增,调节机体免疫反 应、抗炎功能, 已 经成为近些年来生物学及药学领域研究的热点。 抗菌肽是带有正电荷的、螺旋的、序列较短的具有抑菌作用物质的总称,一般是指从各 个生物体包括单细胞生物、植物、昆虫、鱼类、鸟类以及哺乳动物等分离出来的，由1260 个氨基酸残基组成的多肽,分子质量一般小于 10 ku,被认为是先天免疫的重要组成部分,因 为其可以抵抗外来微生物的入侵。抗菌肽由于富含疏水基团,通常存在疏水区和亲水区,并 且对细胞膜显现出两亲性。目前已经有很多学者从食源性蛋白质中分离出抗菌肽,其中研究 最早的是 1966 年从牛乳酪蛋白中分离得到的
3、对多种细菌均具有抑菌作用的 抗菌肽。在 1972 和 1980 年,瑞典科学家Boman 等和 Hultmark 等分别通过诱导眉纹天蚕蛾蛹和惜古 比天蚕( Hyalophora cecropia) 发现了类似的具有抑菌活性的物质。而第一个真正意义上 的抗菌肽就是由 Boman 命名的天蚕素( cecropins) , 该物质对革兰氏阳性和阴性菌都有 抑制作用。此 后各种抗菌物质陆续被发现,其中昆虫和某些非 脊椎动物被广泛研究，迄今 为止已发现超过 2 000种天然存在的抗菌肽。 1 抗菌肽的来源 1.1 来源于昆虫的抗菌肽 昆虫家族抗菌肽的一个典型例子就是天蚕素 (cecropins),包括
4、天蚕素 A 、 B 、 C 、 D 、 E5 种结 构。 天 蚕素具有广谱抗菌活性,其作用机理是天蚕素抗菌肽分子可以在细菌细胞膜上穿孔后 形成离子孔道, 造成细菌细胞膜结构破坏而发挥抑菌作用。它们的 分子中不含半胱氨酸, 呈 线性 - 螺旋结构, 对革 兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强活性, 并且所有昆 虫抗菌肽的 C 端都被酰胺化,这一性质对其广谱抗 菌性极为重要。 昆虫抗菌肽的另一大家族是昆虫防御素( insect defensins)。所有昆虫防御素均带一个净的正 电荷, 都含有 6 个 Cys 并形成 3 个分子内二硫键,呈反平 行 -折叠结构。昆虫防御素对 革兰氏阴性菌的抗 菌活性较弱,
5、且对真核细胞和真菌不起作用,但可 以抗革兰氏阳性菌。 除以上两种,还有多种昆虫抗菌肽,如来自蜜 蜂的 apidaecin 和 abaecin,来自天蚕 H.cecropia 的 attacin A F, 来自家蚕 B.mori 的 moricin 。 1.2 来源于植物的抗菌肽 自第一种植物抗菌肽(Triticumaestivum)从禾本 科植物小麦中被分离出以来,至今已有多种有 活性 的植物抗菌肽被发现并鉴定, 除了硫堇蛋白 ( Thionins),还有环蛋白、富含甘氨酸的蛋 白、snakins 和 hevein 状蛋白。 硫堇蛋白是一类分子量约 5kD 、 氨基酸残基数 4547、富 含半
6、胱氨酸的碱性蛋白。 近来研究表明,硫堇蛋白能抑制多种病原细菌( 如 革兰氏阳性和革 兰氏阴性菌)及真菌的生长。 目前关于防御素的研究是最多的,细胞防御素 (Defensin)对许多种细菌有抑制作用,尤其能抑 制病 原体的增殖。不同种类的植物防御素的一级结构呈多 样性,氨基酸组成相差较大,高含 量的 Cys 形成稳定的二硫键,可能与其生物学特异性功能相关。 然而某 些抗菌肽,如椰汁中 以及石榴种子中富含甘氨酸的 肽,只有多个正电荷不含二硫键。目前,已分离的大多 数植物防御素都有抗真菌或抗病毒特性, 如 NP-1 可 在几分钟内以低剂量浓度杀灭真菌 C.albicans 。 1.3 来源于动物的抗
7、菌肽 抗 菌肽起初是在无脊椎动物中发现的, 随后在 脊椎动物中也有发现, 这些肽显示出多样的序 列结 构和特异性的靶标。 基因编码的抗菌肽能够在哺乳 动物、 两栖动物、 鱼类、 昆虫等多 种不同生物体的组 织中表达。根据结构与生物学功能将动物抗菌肽分 为防御素和 cathelicidins。防御素含 3 4 对分子内 二硫键, 已经从不同物种中分离出了 80 多种防御 素:包括 - 防御素、 - 防御素和 - 防御素。 从 猪小肠中纯化的抗菌肽 NK- lysin,含有 78 个氨基 酸残基,其分子量为 8924 Da,对大肠杆菌、 巨大芽 孢杆菌、 化脓链状菌、NK- 敏感 型小鼠肿瘤细胞
8、YA C-1 有显著裂解活性。 Cathelicidins 是一类高效 杀死细菌和真菌、 具有 广抗菌谱的抗菌肽。防御素 和 cathelicidins 通过抵挡致病菌入侵而为宿主提供 了第一道 防线,其中一些多肽对未分化的淋巴细 胞、树突状细胞有趋化性,另外还可以诱导细胞因 子 生成、肥大细胞脱粒等。 1.4 来源于微生物基因工程的抗菌肽 利用基因工程重组技术异源表达系统来生产 抗菌肽是一种新模式, 其中, 大肠杆菌是生产抗 菌 肽良好的表达系统,但是这种表达系统可能会表达 异源成分的毒性而对宿主本身造成侵 害,导致表达 水平低下。利用甲基毕赤酵母表达系统生产异源性 的蛋白质,采用补料高密度
9、 培养方法,湿菌体浓度 高达 25%以上,异源蛋白分泌在细胞外,有良好的 表达效果,发酵液的 后处理比较容易。 1.5 来源于人工合成的抗菌肽 近年来,随着人们对抗菌肽研究的深入,科研 人员尝试人工合成抗菌肽,并在医疗应用方面取 得 了一定的成果。利用抗菌肽研制的药物已进入市 场, 如: 美国马盖宁制药公司研发出来 的马盖宁( magainin) 药物可杀死病毒和肿瘤细胞, 柞蚕抗菌肽 能够抑制乙型肝炎和杀灭肿 瘤细胞,在医药上已制 成肾肝宁胶囊治疗肾炎及肝炎等。Sang 等(2007) 化 学合成了一种新 的抗菌肽 cathelicidin(K9CATH), 含 172 个氨基酸残基, 合成
10、的抗菌肽具有广泛的抗 革兰 氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母的活性。 2 抗菌肽的生物活性 2.1 抗细菌活性 大量研究表明, 抗菌肽具有广谱的抗细菌活 性, 能够抑制或杀灭多种革兰氏阳性及革兰氏阴 性 细菌。但不同抗菌肽的抗菌活性存在较大差异, 抗 菌谱亦明显不同。如家蚕抗菌肽的 7 大家族: ce- cropins 、moricins 、attacins 、lebocins 、enbocins 、 gloverins 及 defensins,每个家 族中的抗菌肽抗菌活 性和抗菌谱均不相同。 2.2 抗病毒活性 很多抗菌肽具有抗病毒活性,这些病毒都拥有 膜结构。目前研究表明,抗菌肽主要通过 3
11、种 机制 发挥抗病毒作用。第一种是与病毒的包膜结合而起 作用, 如 - 防御素对疱疹病毒的 作用,美洲鲎素 对人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)病毒的作用;第二种 是抑制病毒繁殖, 如天 蚕 素 A 和蜂毒素在亚毒性浓度下可以通过阻遏基因 的表达来抑制 HIV-1 病毒增殖;第三种是干扰病 毒的组装,如蜂毒素被当作病毒包被蛋白,被病毒 RNA 结 合后,导致 RNA 结构改变,不能和正常蛋 白质结合,从而病毒无法正常组装。 2.3 抗真菌活性 许多抗菌肽具有良好的抗真菌作用,Mg2+ 、Ca2+ 及温度均会影响其抗真菌能力。用天蚕素 A 和蜂
12、毒 素分子的基因片段, 合成杂合肽 CA-ME。杂合肽可 使真菌孢子原生质体的细胞 壁无法恢复,无法维持 细胞的正常形态,杂合肽使细胞膜形成孔洞从而达 到杀菌目的。人和 灵长类动物唾液的组蛋白亦有抗 真菌活性,它与细胞的包膜受体结合后进入细胞内 并定位于线粒体。 2.4 抗寄生虫和原虫活性 抗菌肽对寄生虫、 原虫等具有杀伤作用, 可以有效地杀灭寄生 于人类或动物体内的 寄生 虫和原虫,如疟原 虫孢子、 变形虫和四膜 虫等。 抗菌肽的靶标是 寄生虫的质膜,间接引起细 胞内结构和细胞器的改变, 干扰细胞正常代 谢。Cecropins 的类似物 shiva-1 和蛙皮抗菌肽 蛙素 可以有效杀死疟原虫
13、, 蛔虫体内的抗菌肽可杀灭利 什曼鞭毛虫, 柞蚕抗菌肽 cecropins D 对引导毛滴虫 亦有很好的杀伤作用。 2.5 抗肿瘤活性 抗菌肽对肿瘤细胞有广谱的杀灭作用, 肿瘤细 胞外膜含有较高的酸性磷脂成分, 细胞骨架系 统不 完善,肿瘤细胞相对于正常细胞对抗菌肽的敏感度 高。蜂毒素、天蚕素 A 、爪蛙素和 - 防御素 -1/2 对癌细胞具有选择性杀伤作用。Mai 等发现, 抗菌肽 DP1 可以迅速诱导肿 瘤细胞凋亡。 3 抗菌肽作用机制 近年来由于抗生素的滥用出现了很多耐药性的细菌,而抗菌肽对一些耐药性的细菌具有一定 的抑制作用,这说明其与抗生素的作用机理可能是不同的。至今为止对于抗菌肽的
14、作用机制 还没有一个准确的定论,研究学者提出各种假说,大致可以分为 3 类,一是细胞膜损伤,二是细 胞内杀菌,三是通过参与免疫调节发挥抑菌作用。 3.1 细胞膜损伤机理 细胞膜损伤机理大致可以分为 2 步, 首先抗菌肽选择性的吸附到带有负电荷的细菌细胞膜 表 面,然后通过穿孔或非穿孔模式进行杀菌。 膜穿孔模式可以分为 4 种模型。 第 1 种模型 是桶- 板模型( barrel-stave model) ,抗菌肽吸附到细胞膜 表面后将其疏水基团嵌入到细胞膜 内 部,形成孔 道结构,从而导致细菌的细胞内容物外溢而死亡, 例如 Ctx-Ha; 第 2 种模型是 毯式模型( carpet model
15、) ,抗菌肽改变膜表面张力从而使膜变形, 最 终导致细胞膜的崩解,研究 表明 aurein1.2 就是属于该种作用机制的抗菌肽; 第 3 种模型是环形 孔模型(toroidal- poremodel),抗菌肽通过聚集作 用插入到细胞膜内部, 并诱导细菌磷脂单分子层 弯曲直至形 成直径 1 2 nm 的环洞,最终导致细菌 死亡,例如 Lacticin Q; 第 4 种模型是聚集体模 型 ( aggregate channel) ,抗菌肽会与细胞膜表面的 磷脂分子结合成肽-脂质分子的聚合物而进入 到 细胞中, 从而使细菌受到损伤, 例如 Maculatin1. 1。而非膜穿孔模式认为抗菌肽是结合在
16、 细菌 细胞膜表面, 然后通过扰乱细胞正常生理功能, 例 如影响 DNA 复制、RNA 转录或者 蛋白质合成等, 从而导致细胞死亡。 3.2 细胞内杀菌机制 研究表明有些抗菌肽能穿透细菌细胞膜进入细胞质内,影响细胞的生化进程,从而在细胞内起 到杀菌作用。例如合成的来自 NK -溶解素的 抗菌肽 NK-18,其对革兰氏阴性细菌和阳性菌 都有一定的抑制作用,探究其杀菌机制发现 NK-18 不仅可以破坏细胞膜而杀死细菌,也可以 进入细胞质内与 DNA 结合, 扰乱其生理活性, 从而起到杀菌作用, 这种双重作用机制使 NK- 18 具有很高 的活性及稳定性。 3.3 通过参与免疫调节发挥抑菌作用 然而
17、不是所有的抗菌肽都是通过直接杀菌而发挥作用的,有的可以通过参与免疫调节作用而 发挥其活性。抗菌肽参与免疫调节作用主要有以下几种方式: 降低内毒素诱导的炎症反应; 诱导细胞因子的分泌, 从而募集巨噬细胞等发挥免疫调节作用; 诱导促炎症因子的合成; 调 节适应性免疫作用。虽然这些抗菌肽不能直接杀死细菌,但是其能起到增强机体抗感染的能 力。 抗菌肽能发挥抗菌作用而不伤害正常细胞主要是因为抗菌肽表面的正电荷能与带负电荷的 细 菌细胞膜发生作用,而真核细胞的细胞膜是由不带电荷的中性磷脂、 鞘磷脂和胆固醇组成的,所以 抗菌肽和细菌膜表面的阴离子的相互作用是杀死细菌的关键因素。 此外有学者认为 抗菌肽的氨基
18、酸组成会决定其电荷、 两亲性以及疏水性等性 质,而这些性质恰好会使其作用 方式以及对微生 物细胞的选择性作用起重要影响。 总之,不管抗菌肽的具体作用机制是哪一 种, 毋庸置疑的是,其作用机制与细菌表面细胞膜的 结构和性质有密切关系。 4 抗菌肽的应用 抗菌肽除了具有较广的抗菌谱外,对真菌、寄生虫甚至病毒都有选择性的抑制作用,同时还具 有抗肿瘤、 抗原虫 、促 进 伤 口 愈 合 以 及 调 节 免 疫 系 统 等 作 用,因此抗菌肽在各个行业都有广 泛的应用。 4.1 在医学上的应用 抗菌肽在医学上的应用较为广泛。在肿瘤及癌症治疗方面,很多药物在抑制或杀害癌细胞的 同时对正常细胞也有一定的影响
19、, 而有些抗菌肽 能够选择性地抑制肿瘤细胞及癌细胞而不 影响正 常细胞的生理活动,因此可以用作药物。 例如 乳 铁蛋白肽对肿瘤细胞、 乳腺癌细胞、 胃癌细胞等都 有抑制作用27。多肽药物不仅分子质量小,构效 关系简单,易被改造,而且其 活性接近于蛋白质药 物,疗效显著,因此在新药研发、 生产和使用过程 中有很大优势,是一种 较为理想的药物候选原 料28。同 时 有 许 多 抗 菌 肽 类 药 物 已 投 入 市 场, 例 如 daptomycin 作 为一种阴离子抗菌肽在 2003 年 已获得批准并上市,其可用于因金黄色葡萄球菌 等革兰氏 阳性菌引起的皮肤感染。 抗菌肽不仅可以作为药物还可以作
20、为药物载 体,例如 Laszlo 证明昆虫抗菌肽 pyrrochoricin 的同 系物具有运载疫苗的潜力, 能够作为施药运载工 具30,该发现为抗菌肽的应用提供了 新的思路。 在维护医疗器械方面也有学者进行了相关的研 究,Rai 等31将天蚕素的蜂毒肽 涂布于金纳米粒 子表面并应用于医疗器械中, 证明了其能防止相关仪器设备的感染, 并且固 定化后的抗菌肽对人 体的毒性很低,若将其应用于各种医疗设备中可 以减少维护设备的巨 额费用。 总之,由于抗菌肽的多种优点在药物及医疗 器械等方面都有较好的应用前景。 4.2 在农业及畜牧业上的应用 抗菌肽由于其独特的优点, 在 农业和畜牧业 都有良好的应用
21、。农业上, 抗菌肽在培育抗病品 种的同时也能延长农产品保存期; 畜牧业上, 它可 以杀灭动物体内病原菌, 提高免疫力, 改善 动物生 产性能等,而且添加的抗菌肽安全无残留,不会对 动物产生危害也不会造成环境污染, 为养殖业带 来可观的经济效益。 植物在生长过程中受到不同微生物不同程度 的毒害作用, 通过基因工程将抗菌肽基因导入 农 作物, 可以起到抑制植物病原菌生长的作用, 培育 出新的抗病品种。例如 Osusky 等32 将昆虫抗菌 肽的基因导入土豆中,获得的植株不仅能够抵抗 细菌和真菌的感染,而且该效果 可以维持 1 年左 右。有学者将抗菌肽 Shiva-1 转入烟草中,发现其 可以抵抗青
22、枯假单胞杆 菌的感染, 减轻烟草枯萎 症状, 从而降低烟草死亡率33。抗菌肽不仅可以 在植物生长过程 中起到保护作用,对采收后的农 作物也有一定的防腐作用。 例如在马铃薯中导入 MsrA3 基 因后, 不仅可以减少其生长过程中的疾 病, 而且经改造的马铃薯可以储存超过 2 年而不 受 病原菌侵害34,大大提高了农作物的保存期。 在畜牧业方面,抗菌肽可以作为饲料添加剂 而起到抑制动物体内大肠杆菌、 沙门氏菌等病原 菌 生 长 的 作 用 3 5 , 促 进 畜 类 的 生 长 发 育 , 有 效 提 高 畜产品品质。例如 曹立亭等36将乳酸链球菌素灌 入患有乳房炎的奶牛乳房内, 发现其能促进乳腺
23、 组织的修 复,乳腺上皮细胞合成乳的能力有所提 高,该结果表明乳酸链球菌素有望作为奶牛乳房 炎的 治疗剂。 抗菌肽能够杀灭动物体内细菌和病毒, 从而 提高动物的生产性能, 例如刘红健等37 在母猪的 饲料中添加少量的抗菌肽后,不仅使仔猪的成活 率大大提高,而且平均净增重等也得到了 一定程 度的提高。侯振平等38在对仔猪投喂了大肠杆菌 后 投喂乳铁蛋白素 B( Lfcin B) 和天蚕素 P1( Cec P1) ,发现这 2 种抗菌肽能够在一定程度上改善仔 猪的生长性能,降低腹 泻率,缓解断奶应激,有利于仔猪健康生长。黄木家等39 用 2%的抗菌肽制 剂代替血浆蛋白 粉后, 发现添加抗菌肽组仔猪
24、日 增重有所提高, 饲料转化率有所改善, 有效缓解了 仔猪的断 奶应激综合征,减少了腹泻率,大大提高 了仔猪的健康水平。 在提高动物免疫力方面抗菌肽也有一定的作 用。 Jia 等40将弧菌注射进银大马哈鱼体内, 用 2 种抗菌肽的混合物饲养大马哈鱼,结果表明,抗菌 肽能提高鱼类的抗感染能力,降低大马哈 鱼死亡 率。 姜珊等41在罗非鱼幼鱼饲料中添加适量抗菌 肽后对幼鱼的成长有一定的促进 作用, 而且能提 高其免疫力以及存活率, 但超过一定的剂量则会 产生副作用。吕尊周等42 发现,在饲料中添加一 定量的抗菌肽后能提高鸡的血清免疫水平,促进 脾脏内白细胞介素 2 的基因表达, 从而增强鸡的 免疫
25、力。杨玉荣等43在雏鸡饮水中添加鸵鸟皮肤 抗菌肽, 结果 表明该抗菌肽能够促进雏鸡免疫器 官的发育, 增加 T 淋巴细胞数量, 并增强机体的细 胞免 疫力。 4.3 在食品工业上的应用 在食品工业上,抗菌肽可以作为天然食品防 腐剂添加到食品中, 有效减少大肠杆菌和沙门氏 菌等引起的疾病, 并且和热处理相比可以更 好地 保持食品的风味, 此外, 因有些抗菌肽在高温下仍 具有良好的稳定性, 因此可以用于需 加热的食品 中。例如 Nisin 是由乳酸链球菌分泌的一种能够 抑制部分革兰氏阳性菌的多 肽类物质,是一种安 全的、天然的食品防腐剂,在各种食品中都具有良 好的抑菌效果。现在 有很多国家将 Ni
26、sin 用于食 品防腐剂, 且不少国家对其添加量没有作限制, 例 如英国和法 国等44 。 抗菌肽除了能当作天然防腐剂用于食品中, 还能用作添加剂以提高食品质量, 例如在奶酪中 加入改良的乳酸球菌素 3147,发现其可以通过维 持非发酵乳酸菌菌群的平衡而提高食品风 味45 。 除此之外还可以在食品包装中加入抗菌肽或 者将抗菌肽直接喷洒在食品上从而达到生物活 性 包装的目的46。该法不仅安全卫生, 能有效抑制 致病菌的生长, 而且还能延长食品的保 质期,特别 是对于蔬菜以及肉类食品,将可食用的抗菌肽喷 洒在其表面可以降低其水分流失 速度并维持其良 好的外观47 。 Quintieri 等48在奶
27、酪包装材料上涂 抹了乳铁蛋白 肽,可以 抑制假单胞菌等微生物的生长,并有效延长食品保质期。 总之随着科学技术的发展抗菌肽在 各个行业 都将具有更高的利用价值。 5 抗菌肽应用存在的问题与解决方法 虽然抗菌肽具有多种显著优点,包括安全无 毒、 抗菌谱广、 杀菌浓度低、 稳定性好、 分子质 量 小 、致 敏 性 弱 等 4 9 , 而 且 能 够 有 效 抑 制 或 杀 灭 耐 药 细菌,但是目 前对抗菌肽的研究主要集中在实验 室层次上以及体外试验上,若想将其投入市场或 医学方 面还需解决一系列的问题。下面结合近年 的研究,针对抗菌肽存在的问题和改造策略进行 了分析。 5.1 来源问题 抗菌肽的来源主要有 4 个方面,其一,从生物 体中直接分离纯化,提取出内源性抗菌肽。 抗菌 肽来源广泛,但是其在生物体内的天然含量比较 低,资源有限,而且分离纯化需要借助多种色 谱技 术,生产成本高而且难以大规模生产; 其二,用蛋 白酶对抗菌蛋白进行酶解从而制备抗 菌肽, 虽然 其操作简便, 成本低廉, 且酶解后的产物表现出较 高的活性, 但提取步骤繁琐且效 率低,纯化的成本 比较高,如何对肽键进行定向酶解,快速、 高通量 制备抗菌肽是目前的关键
